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2、素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素）残留量的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定方法。样品均质后, 罗红霉素为内标、乙腈萃取、氯化钠去除蛋白质、正己烷脱脂，采用HPLC-MS/MS选择反应监测(SRM)正离子模式测定,基质匹配标准曲线，同时对畜禽肉中9种大环内酯类抗生素进行定性和定量。实验结果表明, 9种大环内酯类抗生素在0.05 ng2.5 ng之间呈线性关系，相关系数0.9970，平均回收率为75.0%119.9%，方法检出限(LOD)为0.5g/kg，方法定量限（LOQ）为1.0g/kg，相对标准偏差（RSD）在4.7%9.7%

3、。各项技术指标均满足国内外相关法规要求,实现了畜禽肉中9种抗生素残留的同时检测。关键词 畜禽肉；大环内酯；残留；固相萃取；液相色谱-串联质谱； 中图分类号：O 657.7 文献标识码：A 文章编号：大环内酯类（macrolide antibiotics）抗生素以一个大环内酯通过羟基以苷键与13 个去氧氨基糖或二甲氨基糖缩合成碱性苷1，有较强的抗菌活性2。抗菌谱主要为革兰氏阳性菌及某些革兰氏阴性球菌。该类抗生素曾广泛地应用于食用动物作为预防和治疗用药，通常采用饲喂或注射方式，容易造成畜禽肉中存在残留，通过食用途径进入人体。该类药物对人体的不良反应主要是导致茶碱血浓度升高而致中毒、对前庭和耳蜗神经

4、的损害，严重者造成肝肾的严重损害，甚至死亡3，因此，世界各国对大环内酯类抗生素药物残留均有严格的限量要求，欧盟已禁止在供食用动物中的饲料中使用，中国也有相应的要求4，5。因此，建立一种高灵敏度的测定畜禽肉中大环内酯类抗生素的多残留方法是十分必要的。测定动物源大环内酯类抗生素已见报道的主要分析方法有微生物法6、荧光光度法7、紫外分光光度法8、薄层色谱法9、高效液相色谱法10，11、毛细管电泳法(CE)12和液质联用技术LC-MSn法1320等方法。本研究以文献4，10，1321为主要参考，重点研究了畜禽肉中有代表性的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉中9种大环内酯类抗生素的提取和净化条件，确定了提取条件，成

5、功建立了液相-串联质谱测定的方法。4年的实践应用证明，操作简单、回收率稳定、灵敏度高、选择性好，最小检出限均达到0.5 g/kg，可以满足对该类药物残留限量的检测要求。1 实验1.1 试剂与标准溶液甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯；甲酸铵、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠为优级纯；水为GB/T 6682规定的一级水；2%氯化钠溶液，0.1 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液（pH=8），甲醇-水溶液（2+3），0.1 mmol/L甲酸铵溶液；标准物质：林可霉素（lincomycin，LIN）、竹桃霉素（oleandomycin，OLE）、红霉素（erythromycin，ERY）、替米考星（tilmicosi

6、n，TIM）、泰乐菌素（tylosin，TYL）、克林霉素（clindamycin，CLI）、螺旋霉素（spiramycin，SPI）、吉它霉素（kitasamycin，KIT）、交沙霉素（josamycin，JOS）和内标物罗红霉素（luohongmeisu，LH）的纯度95%。吉它霉素购置于Sigma-AL deich Laborchemikalien GmbH，其它购置于Dr.Ehrenstorfer GmbH。5个系列基质标准工作溶液:用样品空白提取液配成内标浓度10.0 ng/mL、9种标准物质含量分别为1.0 ng/mL、2.0 ng/mL 、5.0 ng/mL、10.0 ng/m

7、L、50.0 ng/mL浓度的系列基质标准工作溶液，用前配制。1.2仪器液相色谱-串联质谱仪：AB 3200 Q TRAP配有电喷雾离子源（美国应用生物系统公司）；固相萃取装置；氮气浓缩仪；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg,6 ml）。使用前，依次用10 mL甲醇、10 mL水、5 mL浓度2%氯化钠溶液和5 mL浓度0.1 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液活化，保持柱体湿润。1.3 实验条件1.3.1 液相色谱条件色谱柱：Intersil C18，150 mm2.1 mm，3 m；流动相：A：0.01 mol/L甲酸铵溶液，B：乙腈；流速：0.5 mL/min；进样量：20 L；柱温：

8、40。1.3.2 质谱扫描条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测；电喷雾电压：5 500 V；雾化气压力：0.069 MPa；气帘气压力：0.69 MPa；辅助气流速：0.414 MPa；离子源温度：350；碰撞室出口电压：2.0 V；流速：20 L/min；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。表1 九种大环内酯的定性离子对、定量离子对、碰撞能量和去簇电压Analyte Parent ion Fragment ion Collision energy/V Cone voLtage/V (m/z) (m/z)LIN 407/126 407/126 3

9、7 50407/359 24 50OLE 688/158 688/158 70 30688/544 42 30ERY 734/158 734/158 42 50734/576 28 50TIM 869/174 869/174 62 90869/132 70 90TYL 916/174 916/174 54 80916/145 55 80CLI 425/126 425/126 45 53425/377 28 53SPI 843/142 843/142 48 60843/174 50 60KIT 772/215 772/215 43 70772/109 42 70JOS 828/174 828/1

10、74 45 80828/109 45 801.4样品处理精称5.00 g左右的试样，于50 mL离心管中，加入10.0 L 内标工作溶液和15.0 mL乙腈，静止片刻后于振荡器上剧烈振荡10 min；以4 200 r/min的转速离心5 min；取上清液于另一离心管中，加入2 g氯化钠和10 mL正己烷，剧烈振荡10 min；4 200 r/min的转速离心10 min，小心吸取中间乙腈层12.0 mL于另一离心管中，55水浴中吹至近干。用7 mL磷酸盐缓冲溶液分二次溶解残液，使样液以小于1 mL/min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱。样液全部流出后，依次用10 mL水和5 mL甲醇-

11、水溶液（2+3）洗柱，弃去全部流出液，用真空泵抽干固相萃取柱。再用10 mL甲醇洗脱于15 mL锥形试管中，用氮气浓缩仪于55水浴中吹至近干，准确加入1.0 mL甲酸铵溶液溶解残渣。过0.2 m滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。2 结果与讨论2.1方法的选择根据前人研究资料，重点研究了提取液、样液浓缩、缓冲溶液、固相萃取柱、洗脱剂用量对结果的影响。2.1.1提取溶液、不同固相萃取柱对回收率的影响我们对4种提取溶液和3种固相萃取柱的萃取效率进行了实验，结果见表2。表2 不同提取溶液、不同固相萃取柱对回收率的影响（%）Analyte Varian C18 Bakerbond spe C18 Oa

12、sis HLB Extraction buffer Solution1 Solution2 Methyl alcohol Methyl cyanide LIN 133.8 68.4 10.4 8.7 36.0 89.9OLE 61.0 39.2 40.8 39.3 63.7 74.0ERY 6.3 54.0 95.4 36.9 94.9 93.9TIM 54.6 124.0 91.2 41.1 110.0 103.0TYL 56.6 106.0 61.6 24.1 131.0 84.5CLI 49.4 69.4 66.9 138.0 50.0 126.0SPI 82.4 99.8 88.9 2

13、6.0 147.0 123.4KIT 7.4 22.6 45.3 22.7 49.0 73.6 JOS 1.5 9.3 61.0 26.4 73.3 97.6注：Solution1：0.1mol/L Sodium hydrogen phosphate; Solution2：0.3% Phosphoric acid - Methyl alcohol(7+3).根据表6实验数据，乙腈提取效率最高，Oasis HLB固相萃取柱的效果最理想。2.1.2缓冲溶液、不同固相萃取柱对回收率的影响考察了固相萃取柱的0.1 mol/L磷酸氢二钠缓冲液、0.1 mol/L碳酸钠缓冲液、0.2 mol/L乙酸钠缓冲

14、液对回收率的影响，对比结果见表4。为确定过Oasis HLB固相萃取柱时，缓冲溶液对回收率的影响，将0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液调整pH值为3、4、5、6、7、8、8、10进行过柱回收率实验。实验结果见表3。表3 三种缓冲溶液对回收率的影响（%）Analyte Sodium acetate Sodium carbonate 磷酸盐缓冲溶液（Sodium hydrogen phosphate） 0.2 mol/L 0.1 mol/L 0. 1 mol/LpH值 3 4 5 6 7 8 9 10LIN 1.7 20.9 66.9 96.0 77.7 116.0 102.0 92.0 111.0

15、 33.8OLE - 76.2 66.6 79.4 62.3 66.8 77.2 78.4 72.8 80.2ERY 27.7 37.5 6.3 30.4 41.6 55.2 40.4 78.0 113.0 74.4TIM 71.1 24.1 8.3 4.3 3.4 45.0 42.3 72.0 94.2 103.2TYL 7.4 15.2 56.6 81.8 58.6 83.0 58.0 85.6 72.6 66.0CLI 22.6 2.6 49.4 58.0 43.6 47.0 50.4 70.0 63.4 41.8SPI 3.4 1.1 3.3 5.7 5.1 15.6 3.0 83.2

16、 83.0 15.5KIT 1.1 1.5 7.4 18.6 8.2 11.8 13.4 68.8 73.6 8.3JOS 1.1 1.1 14.7 52.4 21.2 42.8 32.4 67.6 61.6 21.4从表4中数据表明，0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液优于其它两种缓冲溶液，缓冲溶液pH值=8时，回收率均在67.5%以上。因此，选择缓冲溶液pH值为8的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为固相萃取柱的缓冲溶液。第 12 页 共 12 页2.2 液相色谱条件对色谱柱进行了优化，选择Intersil C18，150 mm2.1 mm，3 m，使分离效果达到最佳；确定进样量为20 L，流

17、速为0.5 mL/min，柱温：20 C，再对流动相梯度洗脱条件优化（A：0.01 mol/L甲酸铵溶液，B：乙腈），使样液中九种大环内酯类抗生素分离效率达到最佳。梯度洗脱条件见表4。表4 梯度洗脱条件Table 8 Gradient conditionsTime（min） Flow rate（mL/min） A B0.0 0.50 95 51.0 0.50 95 56.0 0.50 40 606.1 0.50 5 9510.0 0.50 5 9510.1 0.50 95 520.0 0.50 95 52.3 质谱条件用注射泵将含有罗红霉素内标的9大环内酯类抗生素混合标准溶液以20 L/min

18、的速度直接注入离子源，用正离子检测方式一级质谱分析（Q1扫描）和二级质谱分析（子离子扫描），然后再对去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）、电喷雾电压、雾化气和气帘气压力进行优化，使每种抗生素的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大，从中选择每种抗生素的监测离子对；将液相色谱和串联四极杆质谱仪联机，对离子源温度、辅助气流速进行优化，使每种抗生素的离子化效率达到最佳。九种大环内酯类抗生素参考保留时间分别为LIN 6.96、OLE 7.36、ERY 8.06、TIM 8.36、TYL 8.48、CLI 8.51、SPI 8.67、KIT 8.83和JOS 9.14 min。九种大环内酯类抗生

19、素标准物质检测离子图，见图1。2.4线性范围和测定低限用空白样品提取液配制基质标准工作溶液，进样量20 L，用峰面积对基质标准工作溶液中被测组分的浓度作图，其线性范围、线性方程和线性相关系数见表5。表5 九种大环内酯类抗生素线性方程和相关系数9种抗生素在0.05 ng2.5 ng范围时，响应值均在仪器线性范围之内。在信噪比S/N5的条件下，每种大环内酯类抗生素的检出限（LOD）均为0.5 g/kg，其定量限（LOQ）1.0 g/kg，满足检测要求。线性方程和相关系数见表5。2.5方法的回收率和精密度用不含九种大环内酯类抗生素的牛肉样品进行添加不同浓度标准后，摇匀，放置一段时间使标准样品充分吸收

20、。然后按本方法进行提取、净化、测定，其回收率和精密度见表6。表6 九种大环内酯类抗生素添加回收率与精密度实验数据（%）从表6中的回收率及精密度数据可以看出，在1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg添加水平上，回收率数据全部在75.0%116.9%之间，室内四个水平相对标准偏差均在9.9%以内，说明该方法重现性很好。2.6 方法的适用性用羊肉、鸡肉、牛肉、猪肉采用本方法在1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg四个添加水平，对九种大环内酯类抗生素进行添加回收率实验，其分析结果见表7。表7. 方法的适用性添加回收率（回收率%）品种

21、牛肉Beef（g/kg） 羊肉Mutton（g/kg） 猪肉Pork（g/kg） 鸡肉chicken（g/kg） 水平 1 2 5 10 1 2 5 10 1 2 5 10 1 2 5 10CLI 110.3 79.7 88.3 85.0 114.3 76.8 83.6 79.4 76.7 114.4 82.3 88.4 82.2 76.5 80.6 81.8LIN 112.4 79.4 91.8 79.4 76.9 108.4 112.3 81.6 80.0 76.9 76.8 80.2 82.1 76.4 88.3 79.2JOS 114.3 89.7 76.3 82.4 119.8 11

22、7.6 116.3 118.5 76.4 78.2 81.6 79.3 118.3 115.2 119.3 115.4ERY 116.9 106.8 94.3 92.4 119.9 118.4 114.3 117.6 76.3 80.8 75.2 79.2 75.5 83.4 76.9 78.1SPI 77.5 116.2 81.6 92.5 75.3 118.3 76.8 76.7 85.6 119.3 76.4 77.7 75.0 75.2 79.3 78.4TIM 76.4 88.3 79.4 86.9 119.2 76.6 79.4 78.9 75.2 81.3 79.9 77.6 7

23、7.6 91.2 79.6 77.4TYL 114.2 78.6 92.7 90.6 85.9 79.3 76.4 88.1 78.6 79.2 85.4 81.0 75.4 81.8 76.2 79.3OLE 80.5 106.3 79.2 94.3 82.3 95.4 76.5 78.0 77.1 81.7 80.9 76.3 82.4 79.3 88.0 76.9KIT 82.3 110.3 113.6 78.4 75.1 76.2 78.3 81.0 112.3 79.4 82.1 113.6 79.1 108.2 93.4 77.7在九种大环内酯类抗生素出峰区域未见干扰峰，样品的回收

24、率在75.0119.9之间，所做空白样品实验也表明，对于羊肉、鸡肉、牛肉、猪肉等样品，本方法的适用性很好。2.7方法的实验室间验证本方法经8个实验室进行重复性和再现性验证。用不含九种大环内酯类抗生素的牛肉样品分别做1.0 g/kg、2.0 g/kg、5.0 g/kg、10.0 g/kg四个水平的添加回收率实验，验证结果见表8。表8. 8个实验室验证实验统计表（g/kg，回收率%）表12. 8个实验室验证实验统计表（牛肉，g/kg，回收率%）（续3） 名称泰乐菌素竹桃霉素吉它霉素单位 水平1.02.05.010.01.02.05.010.01.02.05.010.010.861.504.029.

25、350.851.804.498.210.851.864.417.980.881.553.999.030.861.854.488.480.851.854.287.9120.821.544.009.090.881.594.387.960.821.644.349.040.831.544.038.920.901.634.298.150.801.704.328.9930.871.534.268.840.821.744.098.880.841.784.428.890.861.594.388.940.821.774.248.970.861.824.399.0540.881.554.178.930.821.624.018.970.851.804.349.080.881.574.258.850.841.684.118.880.881.804.268.9650.851.494.328.600.881.634.669.120.821.734.498.390.851.524.298.440.881.624.599.200.851.674.308.2060.871.534.197.930.821.754.098.880.841.784.428.990.861.594.037.840.8201.774.248.970.8651.824.399.0570.911.554