SDSAGE蛋白电泳方法

1、SDS-PAGE实验原理SDS与蛋白质结合SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键 还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下， SDS 与大多数蛋白质的结合比例为1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的

2、SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比 的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与 椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约 60mL双蒸水，充分搅拌溶解 后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4C贮存，每过1-2个月应重新配制；注意:丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5 mol/

3、L Tris-HCI ，pH 8.8，100mL):称取Tris 18.2g溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCI调整pH值至8.8,加双蒸水定容到 100mL，4 C 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl ，pH 6.8，100mL):称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl调整pH值至6.8,加双蒸水定容到 100mL， 4C 贮存；电泳缓冲液(1L):称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约 400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3,无需再调)

4、，4 C 贮存，可重复使用5-6次；2R加样缓冲液(10mL):取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH6.8)2.0mL4.0mL10%SDS溶液甘油2.0mL2.0mL巯基乙醇溴酚蓝0.02g ，混匀后1mL分装，-70 C可贮存6个月;10%AP :称取(NH4)2S2O3 1.0 g,溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份 1mL，-20 C贮存;TEMED :分装成每份1mL，4 C避光贮存; 水饱和正丁醇（100mL）:在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期 保存。染色液（100mL）:称取考

5、马斯亮蓝 R-250 0.25g,加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤 除去不溶颗粒；脱色液（1L）:分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。其他器材：容量瓶（1L、100ml、10ml）、烧杯、离心管（15ml、1.5ml）、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液 缸等。分离胶配方（100mL，4块胶）分离胶中丙烯酰胺的终浓度（）贮液8.09.010.011.012.013.014.015.016.017.018.0凝胶贮液（mL）26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.

6、6760.00分离胶缓冲液（mL）25双蒸水（mL）46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.2010%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05 (抽气后添加)堆积胶配方（40mL，4块胶）贮液一堆积胶中丙烯酰胺的终浓度 （）3.04.05.0凝胶贮液（mL）4.005.366.66分离胶缓冲液（mL）10.0双蒸水（mL）25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04 （抽气后添加）三.操作步骤样品处理：在密封的螺盖微量离心管中，用

7、2R加样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶液，于100C煮沸3-5min，分子质量标准品也经上述处理凝胶制备：将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用 75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；配制 12% 的分离胶，加入 TEMED 前抽真空 10min 以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入 TEMED 后轻轻振荡混 匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，给堆积胶留出约 1cm 的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁 醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在 30min-50min 内聚合完 成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化；倒掉覆盖层并用蒸馏水清

8、洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破坏凝胶表面；制备堆积胶并 迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。堆积 胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加样：将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序加样，每孔加入20 L,在对照孔中加入分子质量标准品6-7 L,如有空置的加样孔，加入等体积的 1R加样缓冲液。电泳：将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80

9、V ，而在分离胶阶段电压调整为120V。直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，断开电极。从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下 凝胶后切除一角以标注凝胶方位。染色：将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利用。脱色：染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3 次.记录：将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标蛋白的分子量。四 . 注意事项：SDS 与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则SDS 结合量不足。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，并且SDS-PAGE测定分子量有10% 误差。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（a胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝