《色谱分析总复习》PPT课件.ppt

1、2021/1/8,色谱分析总复习,教学内容,1 概论 2 基本理论 3 气相色谱（GC） 4 高效液相色谱法（HPLC） 5 平面液相色谱法 6 超临界流体色谱法 7 毛细管电泳 8 色谱的定性和定量分析,7,2021/1/8,第一章 概论,Introduction,2021/1/8,色谱操作基本条件有相对运动的两相： 固定相（Statinary Phase)碳酸钙 流动相（Mobile Phase)石油醚,色谱法中，将填入玻璃管内静止不动的一相称为固定相，自上而下运动的一相称为流动相，装有固定相的柱子称为色谱柱,色谱分析法原理： 被分离的各组分是在两相之间反复进行分配，被分离组分与流动相和固

2、定相都有可能发生作用，但被分离的各组分的结构和性质不同，决定了它们在流动相和固定相之间的作用力也不同，导致各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差异，经过反复多次的分配，随流动相向前移动，各组分运动速度不同，彼此分离,2021/1/8,色谱分离的原理是什么,Question,2021/1/8,按两相所处的状态分,流动相,固定相,类型,液体,气体,液相色谱法 LC,气相色谱法 GC,固体,液体,固体,液体,液-固色谱法 LSC,液-液色谱 法LLC,气-固吸附色谱 法GSC,气-液分配色谱 法GLC,超临界流体,Question：色谱法的分类,2021/1/8,按色谱过程的分离机理分： 分配色谱

3、法（AC）：液体作固定相，利用不同在互不相溶的两相溶剂中的分配系数（溶解度）的不同。 吸附色谱法（DC）：吸附剂作固定相，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差异。 离子交换色谱法（IEC）：用离子交换剂作固定相，利用其对不同离子的交换能力的差异。 凝胶渗透色谱法（GPC）：也叫尺寸排阻色谱（MEC），用凝胶（或分子筛）作固定相，利用凝胶对分子大小或形状不同的组分有不同的阻滞作用。 亲和色谱法：生物分子之间特异的亲和力和可逆亲和反应而分离,2021/1/8,按固定相的性质分： 柱色谱法（CC）：将固定相装于柱管（玻璃管或锈钢柱）内，构成色谱柱，利用其分离混合组分的方法。 填充柱色谱：将固定相装于

4、色谱住内，内径为2-6mm，长几米； 开管毛细管柱色谱：将固定液涂于毛细管内壁上，内径为0.20.5mm,2021/1/8,平面色谱法 薄层色谱法（TLC）：将固定相涂布于平板（玻璃板）上，制成薄层板，点样后用展开剂（流动相）将其展开，然后将薄层板斑点定位后进行定性和定量分析的方法,纸色谱法（PC）：以滤纸为载体，以滤纸上面吸附的水为固定相，然后与薄层色谱法相同的操作形式进行分离分析的方法,按照色谱动力学过程分: 冲洗色谱法（洗脱法）：以与固定相作用弱的组分为流动相，组分按照与固定个作用力、吸附力或溶解力的差异，由弱到强先后洗出，是最为广泛的色谱方法。 顶替色谱法：样品输入色谱柱后，用一种与固

5、定相作用力极强的置换剂通往色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。具有上样量大、产率高且易于操作等优点。 迎头色谱法：以试样混合物为流动相，与固定相作用力弱的组分最先以纯物质状态流出，适用于少数几个组分混合物的分离、纯化，处理样品量大,2021/1/8,2021/1/8,按照色谱技术分 程序升温气相 色谱法：适宜沸点范围较宽的试样。 反应气相色谱法：利用适当的化学反应将难挥发试样转化为挥发的物质，然后以气相色谱法分析。 裂解气相色谱法：将分子质量较大的物质在高温下裂解后进行分离检定，已应用于聚合物的分析。 顶空气相色谱法：适于挥发性大的组分分析。 毛细管气相色谱法：采用高分辨能力的毛细管色谱

6、柱来代替填充柱分离复杂组分的色谱柱。 多维气相色谱法：用多柱或多检测器的基础上，还要使用多通阀或通过改变串联双柱前后压力的办法来改变载气在柱内的流向。 制备色谱法：以色谱技术来分离、制备较大量纯组分的有效方法,色谱分析法特点与局限性,高选择性 分离效率高，分析速度快 高灵敏度，样品用量少 应用范围广,2021/1/8,局限性： 被分离组分的定性较为困难； 定量需标准物对检测器信号进行修正； 对某些异构体、某些固体物质的分析能力较差,色谱图和相关术语,色谱流出曲线色谱图（Chromatogram,2021/1/8,1.色谱图,样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(el

7、ution profile,图 色谱流出曲线,色谱流出曲线的意义,根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数。 根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析。 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据,图2-1 色谱流出曲线,2. 基线 (baseline)：当没有组分进入检测器时，色谱流出曲线是一条只反应仪器噪声随时间变化的曲线，称为基线。 3. 色谱峰（peak)：有组分流出时，出现的峰状微分流出曲线。 4. 峰面积（A，peak area)：组分的流出曲线与基

8、线所包围包围的面积，称为该组分的峰面积。 5. 峰底 （peak base)： 色谱峰下面的基线延长线。 6. 峰高 （h，peak height）：色谱峰最高点至峰底的垂直距离。 7、峰宽（W，peak width,2021/1/8,沿色谱两侧拐点处所作的切线与峰底相交两点之间的距离,2021/1/8,14. 死体积（VM, dead volume）：不被固定相滞留的物质的保留体积。 15. 调整保留体积（VR , adjusted retention volume)：减去死体积后的保留体积,2021/1/8,第二章 基本理论,Basis Theory of Chromatograph,色谱

9、基本参数,1）死时间（tM）Dead time： 不被固定相吸附或溶解的组分（如空气、甲烷等）从进样开始到色谱峰顶所对应的时间。 2）保留时间（tR）Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间,2021/1/8,保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,3）死体积（VM）Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积。 4）保留体积（VR）Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积。 调整保留体积（VR ）adjusted

10、retention volume：是指减去死体积后的保留体积。 校正保留体积（ VR0 ）Corrected retention volume:用压力梯度校正因子修正的保留体积 净保留体积（VN）Net retention volume：用压力梯度校正因子修正的调整保留体积 比保留体积（ Vg ）Specific retention volume:每克固定液校正到273K时的净保留体积,2021/1/8,5）相对保留值 Relative retention value 在相同的操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比。用以衡量这两种组分被分离的效果，是色谱选择性的量度。 6）保留指数（I）R

11、etention index 定性指标的一种参数，通常以色谱图上位于待测组分两侧的相邻正构烷烃的保留值为基准，用对数内插法求得。每个正构烷烃的保留指数规定为其碳原子乘以100. 7）相比率（）Phase ration 色谱柱中流动相与用于分配的固定相体积之比。 8）分配系数 （K）Distribution coefficient 在平衡状态时，组分在固定相与流动相的浓度之比。主要受柱温与柱压的影响,2021/1/8,9）容量因子（k）Capacity factor 在平衡状态时，组分在固定相与流动相中的质量之比，除了受柱温与柱压的影响外，也受流动相与固定相的体积影响。 10）柱效能 Colum

12、n efficiency 色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素（操作参数）所决定的分离效能，通常用理论塔板高或有效板数表示。 理论板数（n）Number of theoretical plate：表示柱效能的物理量。 理论板高（H）Height equivalent to theoretical plate：单位理论板的长度 有效塔板数 （neff）Effective plate number：减去死体积后表示柱效能的物理量,2021/1/8,11）分离度（R）Resolution 两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与平均峰宽值之比来表示，是衡量相邻两组分分离情况的尺度。 12）

13、分离数（SN）Separation number 两个相邻的正构烷烃峰之间可容纳的峰数。 13）载气流速（Fc）Flow rate of carrier gas 在色谱柱出口的温度压力下测得并校正到柱温（Tc）时的流动相体积流速。 14）载气平均线速（u）Mean linear velocity of carrier gas 载气沿色谱柱轴向移动的平均速度,2021/1/8,15）压力梯度校正因子（j）Pressure gradient correction factor 用以校正在色谱柱中由于流动相的可压缩性所产生的压力梯度的因子。 16）液相载荷量 Liquid phase loading

14、 在填充柱中，固定液与固定相（包括固定液和载体）的相对量，用质量百分数表示。 17）柱外效应 Extra-column effect 从进样系统到检测器之间色谱柱以外的气路部分，由于进样方式，柱后扩散等因素对柱效能产生的影响,2021/1/8,选择因子,式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号表示,色谱分离过程是非常复杂的过程，它是色谱体系热力学和动力学过程的综合表现。热力学过程是指组

15、分在体系中分配系数相关的过程，动力学过程是指组分在该体系两相间扩散和传质的过程。组分、流动相和固定相三者的热力学性质使不同组分在流动相和固定相中具有不同的分配系数，分配系数的大小反映了组分在固定相上的溶解挥发或吸附解吸的能力。分配系数大的组分在固定相上的溶解或吸附能力强，因此在柱内的移动速度慢；反之，分配系数小的组分在固定相的溶解或吸附能力弱，在柱内的移动速度快。经过一定时间后，由于分配系数的差别，使各组分在柱内形成差速移行，达到分离的目的,平衡理论,2021/1/8,1)分配系数（ partion factor） K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在

16、一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K 表示，即,分配系数是色谱分离的依据,分配系数K和分配比k,2021/1/8,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 同一组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出,2021/1/8,2)分配比 （Partion ration）k,分配比是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比,k值越大，说明组分在固定相中的量越多

17、，相当于柱的容量大，因此又称容量因子(capacity factor)或容量比(capacity factor),它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数,塔板理论柱分离效能指标,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个分馏塔，沿用分馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标,柱效方程,2021/1/8,色谱峰越窄，塔板数n越多，板高H就越小，柱效能就越高,气相色谱填充柱的n在103以上，H在1mm左右； 毛细管n为105106，H在0.5mm左右,不同物质在同一色谱柱上柱效能不同,原因,不同物质在同一色谱柱上分配系数不同,有效塔板数和

18、有效塔板高度,因组分在tM时间内不参与柱内分配，所以计算出来的n大于实际柱效，因此需引入有效塔板数和有效塔板高度,2021/1/8,为什么组分在tM时间内不能被分离,tM为以一定的载气体积通过死体积区域所消耗的时间,死体积包含从进样口到检测器出口一切未被固定相占领的空间,成功地解释了色谱流出曲线的形状及浓度极大值的位置； 阐明了保留值与K的关系； 提出了评价柱效能高低的n和H的计算公式,塔板理论的贡献,塔板理论假设的缺陷,在气相色谱中，忽略分子轴向扩散； 流动相的运动是跳跃式的、不连续的假设显然违背了实际色谱过程； 实际色谱过程难于达到真正的平衡状态； 分配系数与浓度无关只在一定的范围内成立,

19、2021/1/8,2021/1/8,速率理论影响柱效的因素,1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。 他指出：溶质分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所生成的分子扩散及传质阻力使气流两相间的分配平衡不能瞬间达到是造成色谱峰扩展、柱效下降、板高增加的主要原因。因此，他认为影响板高（或n或色谱峰展宽）的因素由三项构成,涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项,一般填充柱的速率理论方程（Van Deemter方程,范氏方程,

20、2021/1/8,理论塔板高度,流动相的线速度,涡流扩散项系数,分子扩散项系数,传质阻力项系数,A，B，C为常数，减小A、B、C三项可提高柱效,A、B、C三项各与哪些因素有关,2021/1/8,A项: 涡流扩散项,涡流扩散项,均匀性因子,粒径,A=2dp,固定相颗粒越小，dp，填充得越均匀，A，H，柱效，色谱峰较窄，因此为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。 对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此A0,B2Dg,a. 扩散导致色谱峰变宽，H（n）分离变差； b. 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间。 c. 扩散系数： 通常为Dg0.011 cm2s-1,称弯

21、曲因子，填充柱色谱，1；毛细管 ，1。Dg ：组分组分分子在流动相中的扩散系数（cm2s-1,utR T或M Dg,B/uH，n 柱效,B项: 分子扩散项（纵向扩散项,由于存在着浓度差，产生纵向扩散色谱峰 展宽,C项：传质阻力项,1)对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数CL两项，即 C C g + C L,2021/1/8,a. 气相传质阻力项（Cg,容量因子,气相扩散系数,试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展,2021/1/

22、8,b. 液相传质阻力项（CL,固定相的液膜厚度,液相扩散系数,试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展,将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程,这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响,液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示,试样分子从流动相进入固定液内进行质量交换的传质过程与液膜厚度df平方成正比，与试样分子在固定液的扩散系数Ds成反比,该式与

23、气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项,综上所述，对液液色谱的Van Deemter方程式可表达为,2021/1/8,44,色谱分离度及其分离条件的选择,对于常规分析工作，一般选用： 选择性系数（相对保留值）与保留指数I来评价固定液 有效塔板数N有效来评价色谱柱与分离条件 以分离度R作为柱的总分离效能指标,2021/1/8,分离度R,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对实际分离程度，即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离. 难分离物质对的分离程度大小受色谱过程中两种因素的影响： （1）保留值之差色谱过程的热力学因素； （2

24、）区域宽度色谱过程的动力学因素,色谱分离中的四种情况,讨论： （1）柱效较高，K较大，完全分离； （2） K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； （3）柱效较低， K较大，但分离不好； （4） K小，柱效低，分离效果更差,2021/1/8,分离度的表达式,定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和一半的比值,R0.8：两峰的分离程度可达89%，有部分重叠； R1：分离程度98%； R1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准,色谱分离基本方程式 令k1k2=k,W1W2W ，由塔板理论公式和分离度表达式，得,在实际应用中，往往用neff代替n,处理上式可得,可以看出，后者

25、为基本色谱分离方程式又一表达式,色谱分离基本方程的启示,2021/1/8,n,分离度与柱效的关系,n,n,n,n,分离度与选择因子的关系,2021/1/8,分离度与容量因子(k)的关系,分离度与分析时间的关系下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系,可见，分析时间与分离度呈正相关关系，且为指数关系，分离度越大，所需分析时间越长,1、已知物质A和B在一根30.0cm长的柱上的保留时间分别为14.60min和16.73min，不被保留组分通过该柱的时间为1.20min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算： （1）柱A、B的分离度； （2）柱的平均塔板数； （3）塔板高度,2021

26、/1/8,2021/1/8,第二章 气相色谱法,Gas Chromatography,2021/1/8,GC的特点,选择性好，分离效能高 样品用量少，灵敏度高 分析速度快，操作简单 应用广泛，b.P. 400 不足之处：不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质 及蛋白质、核酸 等生物样品的分析,气相色谱分析是一种分析技术，以其高分离效能、高检测性能、分析快速而成为现代仪器分析中应用最广泛的一种方法,2021/1/8,二、气相色谱基本流程 Process of Gas Chromatograph,1-载气钢瓶；2-减压阀； 3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；7-进样口；8-色谱柱；

27、9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪,气源系统,进样系统,柱系统,检测系统,温控系统,数据采集 及 处理系统,气相色谱工作原理,2021/1/8,利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰,2021/1/8,柱系统（色谱柱、分离柱,色谱柱：色谱仪的心脏，核心部件。试样在柱内运行的同时得到所需要的

28、分离。 柱的材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米，长度可根据需要确定。 柱的填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。 柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压力大，流速慢或将 柱堵死，反之空隙体积大，柱效低,填充柱,毛细管柱,2021/1/8,检测系统,对柱后已被分离的组分进行检测，有的仪器还包括柱后转化，如硅烷化装置、烃转化装置，是色谱仪的眼睛，通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成； 被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示，给出色谱图； 检测器：广普型对所有物质均有响应； 专属型对特定物质有高灵敏响应； 常

29、用的检测器：热导检测器、氢火焰离子化检测器,七种醇类检测色谱图,2021/1/8,温控系统,控制并显示进样系统、柱箱、检测器及辅助部分的温度。温度是色谱分离条件的重要选择参数，气化室、柱箱、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度； 气化室：保证液体试样瞬间气化,柱箱：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，柱箱温度需要按一定程序控制温度变化，保证各组分在最佳温度下分离,检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝,色谱图 前伸峰 拖尾峰 畸峰 反峰 假峰 净保留体积 比保留体积 相比率 分配系数 容量因子 相对保留值 柱外效应,2021/1/8,色谱图,气相色谱常用术语及参数,色谱流出曲线,反吹

30、老化 柱流失 填充柱 微填充柱 毛细管柱,2021/1/8,反吹（backflushing）：一些组分被洗脱后，将载气反向通过色谱柱，使另一些组分向相反方向移动的操作，其目的是为了使组分从色谱柱相反方向洗脱，可节省时间，或使组分不进入会受其污染的另一色谱柱。 老化（conditioning）：色谱柱在高于使用柱温下通载气进行处理的过程，老化的温度不可超过固定液的允许最高使用温度，老化时间一般10h左右。 柱流失（column bleeding）：固定液随载气流出柱外的现象。 填充柱（packed column）：填充固定相的色谱柱。 微填充柱（micro-packed column）：填充微粒

31、固定相的色谱柱，其内径一般为0.51mm。 毛细管柱（capillary column）：内径一般为0.10.5mm的色谱柱，分为空心柱和填充毛细管柱两种,2021/1/8,GC的分类,1.固定相,2.分离原理,3.柱子粗细,气固色谱,气液色谱,吸附色谱,分配色谱,填充柱色谱（内径4mm-6mm,毛细管柱色谱（内径0.1mm-0.5mm,2021/1/8,气固色谱固定相 Stationary Phases in Gas-solid Chromatograph,种类,优点,缺点,能在高温下使用；用于分析永久性气体及其他气体混合物、高沸点物或极性很强的物质,制备重复性差，预处理及操作条件有许多特殊

32、要求，严重地影响使用,2021/1/8,气固色谱固定相的特点,1）性能与制备和活化条件有很大关系； （2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差异较大； （3）种类有限，能分离的对象不多（用于分析永久性气体及其他气体混合物、高沸点物或极性很强的物质）； （4）使用方便,2021/1/8,气液色谱固定相 Stationary Phases in Gas-liquid Chromatograph,气液色谱固定相 固定液 + 载体（支持体） 小颗粒表面涂渍上一薄层固定液 固定液 常温下不一定为液体，但在使用温度下一定呈液体状态。 种类繁多，选择余地大，应用范围不断扩大。 载体 化学惰性的多

33、孔性固体颗粒，具较大比表面积,2021/1/8,气相色谱用于分析时，绝大多数是用气液色谱，这是因为色谱固定液在使用时有如下优点： 在通常操作条件下，可获得较对称的色谱峰； 固定液可选择范围广，有众多的固定液可供选用，在分离难分离组分时易于特取最适宜的液； 有质量高的载体与纯度的固定液供使用，因而色谱保留值的重复性极好； 可在一定范围内调节固定液液膜的厚度,2021/1/8,载体固定相与流动相间有尽可能大的接触面积,作为载体使用的物质应满足的条件 比表面积大，且有较好的润湿性； 热稳定性及化学惰性好，在操作条件下表面无吸附性及催化性能，不与固定液和被分析组分反应。 孔径分布均匀，孔结构有利于组分

34、在两相间传质。 粒度均匀，颗粒接近球状，可使柱子渗透性好。 有一定的机械强度，涂渍固定液及填充入色谱柱时，不易粉碎,2021/1/8,固定液操作温度下必须是液态物质,高沸点难挥发的有机化合物，种类繁多； 对固定液的要求：应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应,对组分有良好的选择性 蒸气压低 润湿性好 热稳定性好 化学惰性好 凝固点低，粘度适当 成分稳定性,2021/1/8,如何选用固定液,相似相溶”原理,固定液与分析物质之间起主要作用的力,2021/1/8,1）内聚力：包括色散力、诱导力和定向力 色散力：存在于非极性分子或弱极性分子之

35、间产生，当强极性分子不存在时，色散力在分子间常主要作用，具有加和性，不受温度影响； 诱导力：在一个极性分子永久偶极矩的电场作用下，使另一非极性分子极化，产生诱导偶极矩，这两个分子间形成的相互吸引力，一分子的偶极矩愈大，则另一分子愈易被极化 ，诱导力通常很小； 定向力：极性分子具有永久的偶极矩，两极性分子间的静电作用产生定向力,2021/1/8,2）氢键作用力 XHY,XH 质子给予体,Y 质子接受体,X（ F、O、Cl、N、S等）、Y的电负性越大，氢键的作用力越强； Y的半径越小，越靠近XH，所形成的氢键越强； 氢键作用力介于化学键力与色散力之间； 氢键具有方向性的饱和性，其强度大致按下列次序

36、下降,FHF，OHO，OHN，NHO，NHN，CHO，CHN,强,弱,2021/1/8,3）分子间的特殊作用力化学键力 有时利用固定液与被分离组分分子间生成松散的化学加成即形成弱的化学键这种特殊的作用力来实现组分的分离。 固定液中加入硝酸银，由于银离子烯烃双键上的电子形成弱的络合物，增大了在色谱柱中的保留，使其在同碳数烷烃之后洗脱； 用重金属脂肪酸酯（硬脂酸锌等）作固定液，可选择地分离脂肪胺，出峰次序为叔胺、仲胺、伯胺，因为这促固定液与的络合能力不同,根据固定液与组分分子间的作用力，可得到许多如何分离组分的启示,2021/1/8,1）用非极性固定液分析非极性组分时，分子间主要为色散力，组分按照

37、沸点的顺序得到分离； （2）虽然诱导力一般比其它吸引力小，但是可利用它将能产生不同程度极化的非极性组分分离；如分析丁烯和1,3-丁二烯时，可用极性固定液使后者产生诱导偶极矩，使1,3-丁二烯丁烯之后洗脱出色谱柱； （3）分离极性差别大的组分时，最好用极性强的固定液，如分析2,2-二甲基戊烷与乙醇（沸点为79.2与78.4 ），用甘油作固定液，由于乙醇分子与固定液之间的定向力作用，乙醇后出峰,2021/1/8,4）分析同分异构体时用极性固定液，利用定向力分离它们，因为分子偶极矩是该分子中各键偶极矩的向量和，故同分异构体的偶极矩彼此有较大的差别。如两个相同取代基的芳香族化合物，若其取代位置分别为对

38、、间或邻位，因对位的偶极矩为0，邻位最大， 将按对、间、邻位的顺序洗脱； （5）用同系物作固定液时，分子小的有较高的选择性，这是因为分子间作用力与分子间的距离的6次方成反比，故分析极性组分时，用低分子质量的聚乙二醇，其结果要比用分子质量高的好； （6）当组分含有F、O、N的化合物时，用含有-COOH、-OH、-NH2等功能团的固定液，利用固定液与组分形成氢键来达到分离目的,固定液的选择,2021/1/8,对于已知样品，可按下面的几种方法选择： 相似原则 极性相似选择固定液：固定液的极性与组分的极性具有相似性，根据样品中组分的极性，选择相应极性的固定相。P81 表3-8 非极性样品 鲨鱼烷或OV

39、-101 中等极性样品 OV-225或Carbowax 20M 强极性样品 OV-275 化学官能团相似选择：根据样品的结构来选择，根据样品中组分含有的官能团，选择含有相同官能团的固定液。若有较多支链或同分异构体组分，可用易生成氢键的固定液或液晶,2021/1/8,主要差别选择固定液：根据样品中难分离物质对的情况，看其主要差别是沸点还是极性； 沸点非极性固定液 极性极性固定液 麦氏常数选择固定液：对含不同官能团的样品非常有效；混合固定液：对于复杂的难分离组分通常采用特殊固定液或将两种甚至两种以上配合使用； 利用特殊选择性固定液：特殊选择性固定液对特定样品具有特殊选择性，被分离组分与固定液分子间

40、往往有某些络合物或中间体生成，属于分子间化学作用的结果,2021/1/8,对于未知样品，可按下面的几种方法选择 毛细管初分离 几种最佳固定液： P81 表3-8 SE-30 OV-17 QF-1 PEG-20M DEGS 上述5种固定液，极性间隔均匀，由上而下，极性依次增大，未知样品可先在QF-1上分离，而后换成OV-17，若有所改善， 再减小到SE-30；同理，若由QF-1到V-17分离度变差，可增加极性,极 性,小,大,2021/1/8,常见气相色谱石英毛细管柱一览表,08:40:02,检测器特性Characteristic of Detector,检测器类型 浓度型检测器： 测量的是载气

41、中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测 信号值与组分的浓度成正比，热导检测器。 质量型检测器： 测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比，FID。 广普型检测器： 对所有物质有响应，热导检测器。 专属型检测器： 对特定物质有高灵敏响应，电子俘获检测器,检测原理,使用范围,2021/1/8,2021/1/8,色谱柱及使用条件的选择 Chromatographic Columns and Choice of Operating Condition,固定相的选择 气液色谱，应根据“相似相溶”的原则,分离非极性组分时，通常选用非极性固定相，各组分按沸点

42、顺序出峰，低沸点组分先出峰,分离极性组分时，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰,2021/1/8,分离非极性和极性的（或易被极化的）混合物，一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰,醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离，通常选择极性或氢键性的固定液,组成复杂、较难分离的试样，通常使用特殊固定液，或混合固定相,2021/1/8,柱长和柱内径的选择,增加柱长对提高分离度有利（分离度R正比于柱长L2），但组分的保留时间tR ，且柱阻力，不便操作。 柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时

43、间。 填充色谱柱的柱长通常为13米。 可根据要求的分离度通过计算确定合适的柱长或实验确定。 柱内径一般为34厘米,2021/1/8,柱温的确定,首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内,柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温，被测组分的挥发度，即被测组分在气相中的浓度，K，tR，低沸点组份峰易产生重叠,柱温，分离度，分析时间。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严

44、重,柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。 组分复杂，沸点差异大的混合物，采用程序升温,2021/1/8,程序升温,裂解气相色谱的原理与应用Application and Technology of Pyrolysis Gas Chromatograph,裂解气相色谱（pyrolysis gas chromatograph，PyGC） 热裂解和气相色谱两种技术的结合。 热裂解：在热能作用下，物质发生的化学降解过程； 热裂解+气相色谱+质谱（红外、核磁）技术研究高分子化合物的有力工具； 主要用于一些分子量较大、结构复杂、难挥发、难溶解的物质的分析鉴定，如聚合物分析； 在高分子、生物医学

45、、环境科学、考古学、地球化学、矿物燃料、炸药等领域有广泛应用,2021/1/8,顶空气相色谱的技术与应用Applications and Technology of Headspace Gas Chromatograph,顶空（headspace)GC分析就是取样品基质（固体和液体）上方的气相部分进行色谱分析。也称之为液上色谱分析。 试样置于密闭的恒温系统中，气-液（气-固）两相达到热力学平衡时，测定气相组成。 对液体或固体试样中的挥发性成分进行GC分析的技术；选择性强、灵敏度高、基体干扰小，无需样品前处理,2021/1/8,08:40:03,毛细管柱色谱的特点Feature of Capil

46、lary Column Gas Chromatograph,提高色谱柱分离能力的途径提高柱效 (1)塔板理论：增加柱长，即增加理论塔板数； (2)速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散、分子扩散和传质阻力，采用直径较小，粒度均匀的固定相，即降低理论塔板高度,08:40:03,毛细管色谱柱的结构特点,1） 不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。 （2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。（3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。 （4）毛细管色谱柱柱效高达每米30004000块理论塔板，一支长度100米的毛细管柱，总的理论塔板

47、数可达104106,08:40:03,毛细管色谱具有以下优点,1）分离效率高：比填充柱高10100倍； （2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度 （3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温方式； （4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。 （5）涡流扩散为零,2021/1/8,第四章高效液相色谱分析法,High Performance Liquid Chromatograph,2021/1/8,高效液相色谱法的特点 feature of HPLC,特点：高压、高效、高速、高灵敏度、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法,2021/1/8,1）气相色谱分析中，载气仅起输送作

48、用；而液相色谱分析中，流动相还要直接参加实际的分配过程，要想提高高效液相色谱的柱效，最有效的途径是使用小粒径填料。 （2）HPLC所用的流动相，在进入高压泵前必须脱气，因为色谱柱是带压力操作的，而检测器是在常压下工作，如果流动相中所含的空气不除去，则流动相通过色谱柱时，其中气泡受到压力而压缩，流出柱子后到检测器时因常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声增大，使基线不稳，仪器不能工作。常用的脱气方法有低压脱气法、吹氦脱气法和超声波脱气法,2021/1/8,液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固相吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5

49、10m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 溶质分子与极性吸附剂吸附中心的相互作用， 会随溶质分子上官能团的极性的增加或官能团数目的增加而增强，这会使溶质在固定相上的保留值增大,2021/1/8,不同类型的有机化合物，在极性吸附剂上的保留顺序如下： 氟碳化合物 饱和烃 烯烃芳烃 有机卤化物 醚 硝基化合物腈叔胺酯、酮 、醛 醇 伯胺 酰胺 羧酸 磺酸 溶质保留值的大小与 空间效应有关； 吸附剂的表面结构有关,2021/1/8,分配色谱：以溶质在流动和固定两相中的分配为基础的一种色谱分离方法,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基

50、本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 液-液分配色谱可分为正相色谱和反相色谱 依据：固定相与流动相之间极性的强弱。 对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反,正相分配色谱,组分极性越大，保留时间越长,反相分配色谱,组分极性越小，保留时间越长,固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱,采用硅胶表面键合技术, 对硅胶微粒表面进行修饰-硅

51、烷化, 使得硅胶表面带有不同的功能团, 以适应不同的分离需要。目前在色谱填料中, 键合相约占78%(其中C18占反相色谱的72%), 硅胶约占10,键合相色谱法,反相键合相色谱,常用固定相：C18,分离对象 非极性 中等极性化合物,常用流动相 甲醇-水 乙睛-水,固定相极性流动相极性,正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 以含有极性基团（氰基、氨基、二醇基等）的极性键合相作固定相，以非极性或弱极性溶剂作流动相的色谱法。 主要用于分离异构体和极性不同的化合物,离子性键合相色谱 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同,例：甲苯和

52、苯酚的分离,出峰顺序：苯酚，甲苯,出峰顺序：甲苯，苯酚,十八烷基键合相,二醇基键合相,基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关，亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R-SO3H +M+ = R-SO3 M + H + 阴离子交换：R-NR4OH +X- = R-NR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等,离子交换色谱 ion-exchange chromatography,2021/1/8,离子色谱ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换

53、色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法,2021/1/8,离子对色谱ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-

54、进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配,2021/1/8,排阻色谱色谱size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,2021/1/8,亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种色谱分

55、离方法,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱,2021/1/8,液相色谱固定相 stationary phases of LC,1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料,2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底,

56、2021/1/8,液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反,2021/1/8,流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯

57、、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,2021/1/8,流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小,2021/1/8,选择流动相时应注意的几个问题,1）尽量使用高

58、纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加,2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等,3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积,4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收,从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点,2021/1/8,2021/1/8,第五章 平面液相色谱法,plane chromatography,平面色谱法的分类,按操作方式分为薄层色谱法、纸色谱法、薄层电泳法,1.薄层色谱法 定义：把固定相均匀地铺在玻璃板、铝箔或

59、塑料板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离，称薄层色谱法。 分离原理：随所用的固定相不同而异，与柱色谱相同,纸色谱法 定义：以纸作为载体的色谱法。 分离原理：属于分配色谱的范畴,薄层电泳法 电泳法是指带电荷的分离物质(蛋白质、核苷酸、多肽、糖类等)在纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等支持介质上，向与其相反的电极方向以不同速度泳动(或迁移)而实现分离，然后对组分进行定性和定量的方法。聚丙烯胺凝胶平板电泳等属平面色谱,平面色谱法参数,定性参数 比移值 ，相对比移值,比移值(retardation factor, Rf) 定义：比移值是某一组分移动距离与展开剂移动距离之比。或者说原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比,基本公式： Rf= L/L0 L:原点(origin)至斑点中心的距离， L0：原点至溶剂(solent front)前沿的距离。 要求: 0Rf 1 适宜范围：0.2Rf 0.8 最佳：0.3Rf 0.5,相对比移值(relative Rf ,Rr) 定义：被分离组分与所选参比物质在同一条件下的Rf值(或移行距离)之比,计算公式 Rf = Rf(i) / Rf(s) = L(i) / L(s) 其中 Rf(i)：组分i的Rf值。 Rf(s)：参考物质的Rf值,同一条件 下测得,Rr = Rf(a) / Rf(s) = La