rnai用于基因功能的鉴定和确证.ppt

1、RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鉴定和确证,广州复能基因有限公司 李华平 博士 研发部主任,FulenGen,FulenGen,Gene Function Screening,Mechanism of RNAi (shRNA/miRNA,Comparison of shRNA and miRNA properties,Architecture short hairpin Single-strand Original Exogenous Endogenous No. of intended target 1 Many Degree of gene silence High Low

2、 Complementary to mRNA target Perfect Imperfect Effect on mRNA Endonucleolytic cleavage Repressed translation,shRNA miRNA,FulenGen,FulenGen,shRNA的设计与构建 shRNA的验证 miRNA的克隆与检测 miRNA靶标的确证 基因沉默后的功能拯救,FulenGen,FulenGen,shRNA 表达克隆的构建,载体选择 筛选标记和报告基因 目的细胞,shRNA序列设计 高准确性的预测方法 茎和环序列,有效性检测 3-5个shRNA /基因 目的基因是否表

3、达,克隆和测序 合成引物的长度 茎环结构难以有效测序,保证高表达抑制效率和最低的脱靶效应； 慢病毒载体和以哺乳动物细胞表达载体； 序列已经过测序； 每个基因提供4个克隆，至少有1抑制水平达到70%以上 提供包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究,OmicsLink shRNA表达克隆,FulenGen,经过验证的人类激酶组shRNA表达克隆 350个人类激酶基因的确证shRNA表达克隆 表达抑制效应都经过验证，达70以上 低的脱靶效应,FulenGen,shRNA克隆用于信号通路研究,qPCR Primer array 即将上市,采用先进的算法，精心设计的qPCR引物 扩展长度100250bp

4、； PCR扩展效率90%； 每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性,Exonic Non-coding,MicroRNAs 由RNA Polymerase II转录,Intronic Non-coding and coding,Lee, et al., EMBO J. 23:4051-60 2004,OH,mature and primary microRNA 的结构,Pri-miRNA,Drosha Cleavage site,Mature,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,III 型启动子,II 型启动

5、子,Vector-Based microRNA Expression Clones,FulenGen,OmicsLink Human Precursor miRNA Expression Clones,pEZ-MR02,650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（11.0版本）中已知的678种miRNA的95% miRNA表达框已完全测序确证 基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率 提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控 通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率,FulenGen,miRNA与肿瘤,miR

6、NA的检测和定量,检测方法 Nothernblot Microarray Quantitative Real-time PCR,检测对象 Primary-miRNA Pre-miRNA Mature miRNA,FulenGen,Quantitative Real-time PCR detect miRNA,polyA加尾法,Loop反转录法,通用性高； 适用于同一样本检测多种miRNA 经济、方便,特异性高； 适用于多个样本中检测同一miRNA 价格较高,FulenGen,qPCR 检测miRNA的特异性,qPCR检测miRNA的特异性,qPCR 检测miRNA困难,采用LNA探针,miRN

7、A Target的分析,研究发现，在哺乳动物中，miRNAs的基因抑制作用是通过其5一段长为68nt的核苷酸与mRNAs3端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于 miRNA序列5的28个nt，被称为seed区。 2007年，美国约翰霍普金斯大学发现miR-29b 5的6个核苷酸与该miRNA的细胞定位有关,FulenGen,miRNA 5的seed区域在miRNA家族中具有很高的保守性，对脊椎动物的miRNA target的识别具有重要的作用，尤其是第2-8个碱基,FulenGen,针对HDAC5的三个不同版本的算法的microRNA的预测结果,红色表示第三和第四版重叠的microRNA

8、，黄色表示第四和第五版重叠的microRNA,microRNA,Translation,Degradeation Or Translation inhibition,Light,No Light,Renilla Luciferase data,Firefly Luciferase data,miRNA的编辑及其靶标的变化,miR376a-5p 经过编辑后，其靶标的变化,FulenGen,OmicsLink Human miRNA Target Sequence (3 UTR) Expression Clones,pEZX-MT01,pEZX-MT02,FulenGen,Gaussia lucifer