DB37T 3690.3-2020 液体菌种制备技术规程 第3部分：平菇

1、Q/LB.XXXXX-XXXXICS65.020.20CCSB 05山东省地方标准DB37/T 3690.3202037液体菌种制备技术规程第3部分：平菇Technical specifications for the preparation of liquid spawnPart 3:Pleurotus ostreatus2020-12-04发布2021-01-01实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 3690.32020目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 基本要求24.1 工作人员卫生要求24.2 场所要求24.3 厂房要求24.4 生产设施与设备要求25 生

2、产技术35.1 工艺流程35.2 母种活化35.3 摇瓶液体菌种生产35.4 发酵罐液体菌种生产45.5 贮藏56 生产档案6附录A（规范性） 平菇液体菌种生产记录事项7II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB37/T 3690液体菌种制备技术规程的第3部分。DB37/T 3690已经发布了以下部分： 第1部分：香菇； 第2部分：黑木耳； 第3部分：平菇； 第4部分：灵芝。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省农业农村厅提出并组织实施。本文件由山东省农业标准化技术委员会

3、归口。本文件起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科学研究院、山东省农业科学院农业资源与环境研究所、济南市农业技术推广站、菏泽市定陶区特色农产品服务中心。本文件主要起草人：赵淑芳、高瑞杰、高霞、王庆武、高中强、司元明、张燕、崔慧、桑卫民、黄春燕、韩建东、王晓婷、彭玮航、孙振福、张晓雱、马化彬。DB37/T 3690.32020液体菌种制备技术规程第3部分：平菇1 范围本文件规定了平菇（Pleurotus ostreatus）液体菌种的术语和定义、基本要求、生产技术和生产档案管理等要求。本文件适用于平菇液体菌种的制备。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可

4、少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 150.1压力容器第1部分：通用要求GB 4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB 5749生活饮用水卫生标准GB/T 12728食用菌术语GB 19172平菇菌种GB 50073洁净厂房设计规范NY/T 528食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 食用菌液体菌种发酵罐edible mushroom liquid spawn fermenter进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设备，

5、是利用生物发酵原理，给菌丝生长提供最佳的营养、酸碱度、温度、供氧量等生长条件，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间达到一定菌球数量的专用容器。3.2 罐压jar pressure在液体菌种发酵制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压）。注： 单位为MPa。3.3 通气量ventilation volume在液体菌种培养过程中发酵罐体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的比例。注： 用 V/V（发酵罐体积/通入空气体积）表示。3.4 接种量inoculation amount液体菌种体积与培养基体积的比例。注： 用百分数表示。3.5 液体菌种菌龄period of liquid spawn runni

6、ng液体菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。3.6 发酵罐空消empty fermenter sterilization对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。3.7 发酵罐实消fermenter sterilization对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。3.8 空气过滤器air filter能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。3.9 摇瓶液体菌种liquid spawn in shake flask装至玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或恒温摇床上培养的液体菌种。3.10 终止pHinitial pH value of medium液体菌种达到放灌指标

7、时的培养基pH。4 基本要求4.1 工作人员卫生要求工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间应穿戴经消毒处理的工作服、口罩、鞋、帽等。4.2 场所要求生产场所应符合NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化。生产用水应符合GB 5749要求。4.3 厂房要求4.3.1 厂房设计应符合NY/T 528环境卫生要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。4.3.2 应设置与工作人员数量相适应的更衣室，车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。过道应设置风淋室。4.3.3 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（1.01.5）和良好的排水系统；墙壁和天花板应能防潮、

8、防霉、防水。4.3.4 车间安装排气管道或者排风设备。4.3.5 摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室应符合GB 50073要求。4.3.6 车间设封闭式废物桶。4.4 生产设施与设备要求4.4.1 生产设施培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，布局合理，摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室要有调温设施，其中培养基配制室空间洁净度应达到万级以上。菌种检验室和母种制作室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施。4.4.2 生产设备与用具应具有称量器、高压蒸汽灭菌锅、液体菌种发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设备、除湿设备、恒温培养箱、恒温摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及常规用

9、具。压力容器应经政府有关部门检验合格，符合GB 150.1的要求。应具有备用电源。5 生产技术5.1 工艺流程工艺流程见图1。图1 平菇液体菌种生产工艺流程5.2 母种活化母种活化配方及操作流程应符合NY/T 528要求。活化后母种质量应符合GB 19172要求。5.3 摇瓶液体菌种生产5.3.1 容器要求使用无色或近无色专用玻璃菌种甁，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。5.3.2 培养基配方宜选用以下配方，且培养基质应符合NY/T 528要求：a) 配方1：马铃薯（煮汁）200g/L、葡萄糖20g/L，pH自然；b) 配方2：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾1

10、g/L、硫酸镁0.5g/L、维生素B15 mg/L，pH自然；c) 配方3：马铃薯（煮汁）200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L，维生素B110mg/L，pH自然。5.3.3 培养基配制按液体培养基配方配制，混合均匀，装入摇瓶中，装液量为摇甁容量的50%60%，瓶塞封口，并用报纸或牛皮纸包扎。5.3.4 灭菌将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，锅内留有一定的空隙。检查锅内水位，立即灭菌。灭菌蒸汽压力升至0.11MPa0.13MPa，恒压维持20min30min。5.3.5 接种待培养基冷却至室温，在无菌条件下，用接种针挑取56块（35）mm（35）mm的母种块迅速转接于

11、摇甁培养基内，封口。5.3.6 摇瓶液体菌种培养2325条件下，静置培养24h，然后置于摇床上震荡培养，转速140r/min160r/min，培养时间4d6d。5.3.7 摇瓶液体菌种质量要求菌液澄清透明，菌丝体分布均匀，无异味，有平菇特有的香气；镜检无杂菌、菌丝形态正常。5.4 发酵罐液体菌种生产5.4.1 发酵罐空消发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情况出现其一时，应空消。蒸气压力0.14MPa、温度126，维持40min。5.4.2 发酵罐液体菌种培养基配方宜选用以下配方，且培养基质应符合NY/T 528要求：a) 配方1：马铃薯（煮汁）200g/L、葡萄糖20g/L、消泡剂

12、0.3g/L，pH自然；b) 配方2：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、维生素B15mg/L、消泡剂0.3g/L，pH自然；c) 配方3：马铃薯（煮汁）200g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、维生素B1 10mg/L、消泡剂0.3g/L，pH自然。5.4.3 上罐、定容用水把原料搅拌均匀，加入罐内，装液量为罐体容量的70%80%，通入空气搅拌1min2min，混合均匀，拧紧上料口盖。5.4.4 发酵罐实消发酵罐夹套通入冷水，水位低于排水口20cm，关闭进水阀、排水阀后加热。待夹套蒸汽压力达到0.05MPa时，缓慢打开排气阀

13、降压至0MPa，关闭排气阀，再次升压至0.1MPa0.14MPa；待发酵罐罐内蒸汽压力达到0.05MPa时，缓慢打开排气阀降压至0MPa，关闭排气阀，再次升压至0.11MPa0.12MPa，同时打开空气过滤器灭菌，微开排气阀，维持50min60min。5.4.5 冷却灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开夹套排气阀降压至0MPa，通入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐罐内排气阀降压，待压力接近0.02MPa0.04MPa时向罐内通入无菌空气，调整排气阀，维持罐压0.04MPa0.05MPa，培养液温度降至25以下时，关闭夹套进水阀。5.4.6 接种将摇瓶接种管和发酵罐接种口用75%酒精消毒

14、，用95%酒精的火焰圈套在接种口上，轻微打开呼吸器阀门，使发酵罐罐内压力为0.01MPa。点燃火焰圈，在火焰保护下用镊子去掉接种管上的牛皮纸和瓶塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。接种量为0.5%1.0%。拔出接种管，关闭接种阀门，去掉火焰圈，继续通入无菌空气。5.4.7 发酵培养根据菌丝生长情况，适时调节进气阀门，通入适量无菌空气，通气量一般为1：0.81：1，同时调节排气阀，维持罐压0.02MPa0.05MPa，培养温度控制在2325，培养5d7d。5.4.8 发酵罐液体菌种质量标准5.4.8.1 感官要求感官指标应符合表1的规定。表1 平菇发酵罐液体菌种感官要求

15、项目要求菌液色泽菌丝体呈白色，菌液呈淡黄色菌液形态菌液粘稠不分层，菌丝体分布均匀菌液气味有平菇液体培养时特有的香气，无异味，发酵罐排气口气味正常显微镜下菌丝形态菌丝粗壮，有隔膜，可见锁状联合5.4.8.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。表2 平菇发酵罐液体菌种理化指标项目要求终止pH5.56.5菌丝湿重（mg/mL）505.4.9 液体菌种检测5.4.9.1 形态学观察。主要是通过肉眼观察菌球形态，通过显微镜观察菌丝体形态。5.4.9.2 霉菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量培养液，接种于GB 4789.28中规定的PDA培养基中，置于2830恒温培养48h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状

16、况和有无霉菌污染，必要时进行水封片镜检。5.4.9.3 细菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量培养液，接种于GB 4789.28中规定的营养肉汤培养液中，置于2830恒温培养24h48h，观察是否有细菌污染,必要时进行镜检和划线培养检验。5.4.9.4 pH测定。取样用pH计或pH试纸测定菌液酸碱度。5.4.9.5 菌丝湿重测定。称取一定体积的培养液，经10000r/min离心5min，称重。5.5 贮藏平菇液体菌种生产后应立即使用，如不能立即使用，需进行贮藏。贮藏环境温度低于20。发酵罐内液体菌种，持续通无菌空气，保持罐压0.02MPa0.03MPa，可存放2d。6 生产档案母种、摇瓶液体菌种和发酵罐液体菌种生产的每个环节都要有详实的记录，记录内容应按附录A执行。生产记录归档保存，至少2年。6DB37/T 3690.3