环境微生物学：第7章2微生物的遗传（自学）变异（2学时）

1、第七章（2）微生物的遗传变异,7-3 微生物遗传（自学）,种瓜得瓜，种豆得豆 龙生龙，凤生凤，老鼠儿子会打洞 虎父无犬子 一母生九子，母子十不同 龙生九子，各不相同,遗传的保守性： 正面：继承亲代优点，保持物种延续（优胜） 负面：？（劣汰）,赑屃 bixi,变异的多样性 细菌变异形式，如：个体形态的变化；菌落形态(光滑型粗糙型)的变异；营养要求的变异；对温度、pH要求的变异；毒性的变异；抗毒能力的变异；生理生化特性的变异及代谢途径、产物的变异等,基本概念,遗传：指上一代生物如何将自身的一整套遗传基因传递给下一代的行为或功能 遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的

2、遗传信息。是一种内在的可能性或潜力 表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的综合，是其遗传性在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体表现。是一种现实性,遗传具有保守性 优点：保障优良性状稳定遗传 缺点：环境变化，无法适应而死亡,基本概念,变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，也是遗传型的改变 饰变：外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化,特点： 出现几率低 性状变化幅度大 新性状稳定、可遗传,特点： 群体中的个体几乎都同样变化 性状变化的幅度小 因遗传物质不变，故饰变是不遗传的，引起饰变的因素消失后，表型

3、即可恢复,例如：粘质沙雷氏菌：在25下培养，产生深红色的灵杆菌素；在37下培养，不产生色素；如果重新将温度降到25，又恢复产色素的能力,遗传是相对的，变异是绝对的。 利用物理因素、化学药物处理微生物提高其变异频率，可获得具有优异特性的变异菌株 工业废水生物处理中，可以用含有某些污染物的废水筛选、培养菌种，使其适应并有高效降解其中污染物能力,驯化,微生物遗传的物质基础的经典实验 肺炎双球菌的转化实验 1928年格里菲斯的经典转化实验 1942年埃弗里等的转化补充实验 噬菌体感染实验 1952年赫西和蔡斯用32PO43-和35SO42-标记大肠杆菌T2嗜菌体感染大肠杆菌 病毒的拆开和重建实验,S型

4、和R型细胞侵染试验,分离后的S型细胞物质对R型细胞的转化,噬菌体感染实验,遗传与变异的分子机制,根源？ DNA 核酸是一切生物的遗传物质，核酸包括DNA和RNA，绝大多数生物都是以DNA作为遗传物质的，因此DNA是主要遗传物质,复制传递的稳定性,遗传的保守性,复制传递的差错性,变异的多样性,DNA分子的结构及其多样性 是由4种脱氧核糖核苷酸变化排列组成的双链螺旋结构的大分子 碱基互补原则（靠氢键连接）： A=T （ A=U ） CG 在现代细菌分类鉴定中，通过测定G+C百分含量确定属、种或菌株,碱基之间一一对应，顺序固定，可以保证遗传的稳定性 如果受到干扰，个别碱基排列顺序发生变化，会导致微生

5、物死亡或变异,双螺旋结构：沃森、克里克1953年提出 均为右手螺旋。平均直径2nm，碱基对间距离0.34nm，沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸，螺距3.4nm 1992年我国科学家首先发现具有三股螺旋的天然DNA，其存在已被国际公认 碱基排列顺序的多样性决定了DNA结构的变化无穷,遗传物质在细胞内的存在部位和方式,七个水平 细胞水平 细胞核水平 染色体水平 核酸水平 基因水平 密码子水平 核苷酸水平,DNA在微生物中存在的形式 主要形式染色体 真核染色体外的遗传物质细胞器DNA 染色体外DNA存在的另一形式质粒 在染色体不同部位移动的转座因子等 RNA作为遗传物质 关于朊病毒的遗传物质问题,羊

6、瘙痒病PrPC与PrPSC 分子的三维结构,染色体,真核微生物与原核微生物染色体的区别 真核由DNA及蛋白质（组蛋白）构成 原核单纯的DNA或RNA 真核不止一个，呈线形 原核往往只有一个，呈环形 真核形成核仁，有孔的核膜包被 原核染色体外无膜包被,细胞器DNA,DNA与其他物质一起构成具有特定形态的细胞器结构，并携带有编码相应酶的基因 结构复杂而多样 功能不一，对于生命活动常是不可缺少的 数目多少不一 自体复制 一旦消失，后代细胞中不再出现,质粒,微生物染色体外或附加于染色体的携带有某种特异性遗传信息的DNA分子片段，目前仅发现于原核微生物和酵母菌 质粒DNA与染色体DNA的区别 染色体DN

7、A相对分子量明显大于质粒DNA 大肠杆菌质粒DNA较染色体DNA更为耐碱性 质粒所携带的遗传信息量远较宿主细胞染色体所携带的要小。染色体是关系其生死存亡的初级代谢及某些次级代谢，而质粒只与宿主细胞的某些次要特性有关,游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA(circular,covalently closed DNA)。质粒具有超螺旋结构，分子量一般在106108Da间，大小约为1%核基因组,质粒,某些细菌中的质粒还具有某些特性：如可转移性、可整合性、可重组性、可消除性等 细菌质粒有三种不同的构型：线状、环状和超螺旋，三者之间可以相互转变,质粒,细菌质粒和真

8、核生物细胞器DNA的比较 相同之处： 都可自我复制 一旦消失后，后代细胞中不再出现 它们的DNA只占染色体DNA的一小部分 不同之处： 质粒DNA结构简单，不和其他物质一起构成一些复杂结构 其功能比细胞器更为多样化，但一般并不是必需的，其消失不影响宿主细菌的生存 能通过细胞接触而转移,质粒的复制,严紧型复制控制：质粒的复制与核染色体复制同步 松弛型复制控制：质粒的复制与核染色体复制不同步 质粒消除：含质粒的细胞在正常培养基上遇化学、物理因素处理时，质粒的复制受到抑制而核染色体的复制继续进行，子代细胞中质粒消除 附加体：某些质粒具有与核染色体整合、脱离的功能，这类质粒称附加体,质粒,根据质粒所携

9、带的遗传信息表达后的表型可将其分类如下：,抗药性质粒（R因子） 抗生素产生质粒 芳香族化合物降解质粒（只在假单胞菌属中发现） 大肠杆菌素质粒 （Col因子） 性质粒（F因子）,限制性核酸内切酶和修饰酶产生质粒 致瘤性质粒（Ti质粒和Sym质粒，是植物遗传工程研究中的重要载体） 杀伤性质粒（发现于酵母菌和黑粉菌的致死颗粒，其基因为双链RNA ） 已证实和可能与人类疾病有关的质粒 酵母菌中的2m质粒和其他质粒,基因,存在染色体上，是一切生体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位 基因特別是指在DNA序列上，能够表现出功能的部分 基因按功能可分三类：结构基因、操纵基因、调控基因 在人类的所有

10、染色体上，约存在30,000个基因 有时单一个基因便能控制一种性状的表现，然而，大部分的生理性狀，都是由一系列相关的基因一同调控而表現,基因水平,调节基因也有转录和转译作用，以其模板生成的蛋白质称为阻遏蛋白或变构蛋白 阻遏蛋白的作用是能与操纵基因结合，阻止了RNA聚合酶向结构基因滑动，既使结构基因失去了合成mRNA的能力 阻遏蛋白也能与培养基中的底物(由结构基因转录、转译的酶催化分解的底物)相结合，当阻遏蛋白与底物结合后，阻遏蛋白从操纵基因分离，从而开放了RNA聚合酶通向结构基因的通道，便能转录成mRNA，并转译成蛋白质(酶),细胞中DNA的复制 半保留复制 5 到 3 方向： 有三种不同的D

11、NA聚合酶的参与 多聚酶：修复作用和连接冈崎片段 多聚酶： DNA修复作用 多聚酶：用于DNA新链的合成 限制性内切核酸酶具有高度的专一性,前导链与后随链,RNA与遗传表达 RNA的合成：因子 RNA的类型： 信使RNA（mRNA）：指导蛋白质的合成； 核蛋白体RNA（tRNA）与蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所； 转运RNA（rRNA）：识别mRNA上的信息，并将特定的氨基酸送到rRNA上供蛋白质合成 中心法则,蛋白质合成（翻译） 原核生物的聚核糖体，蛋白质高速合成 起始阶段：氨酰-tRNA 延伸阶段 终止阶段,复制过程： 转录、翻译、表达、调控： 转录水平的调控：操纵子 翻译水平的调控

12、：SD序列、mRNA的二级结构、稀有密码子、反义RNA 在微生物的遗传过程中，基因决定酶，酶决定代谢，代谢决定一切性状的表达和发育,原核生物只有一种RNA多聚酶 转录后不需加工，直接作为mRNA mRNA只能存活几分钟、几小时 转录和转移可同时进行，是偶联的 原核生物的mRNA是多基因的(polycistronic)，即它们编码几个多肽,7-4 微生物变异,微生物的变异与基因突变,突变体：发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,基因突变的机理 自发突变特性：发生随机性与结果无定向性 不对应性：性状与原因无对应性 自发性： 稀有性：突变率低而稳定

13、，10-610-10 独立性：两个突变是各不相关的 诱变性：诱变剂可提高突变率，10105倍 稳定性：突变产生的性状稳定可遗传 可逆性：可发生回复突变修复成功,基因突变在哪一个细菌中发生是随机的，突变基因的部位也是随机的。突变的发生没有固定的方向,每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的机率 十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变,环出效应 互变异构效应 背景辐射和环境因素的诱变 微生物自身有害代谢产物的诱变,DNA损伤的修复（回复突变） 光复活作用：紫外线引起T=T的产生，光解酶和O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶 切除修复：遗传信息来自互补链，DNA聚合酶、DNA连接酶 重组修复：遗传信

14、息来自另外相同或相似DNA分子上相同的片段，重组修复酶 SOS修复：DNA紧急修复基因，DNA分子受到重大损伤时诱导产生的保护DNA分子的一种应急反应,基因突变的自发性和不对应性的证明,两种观点： 细菌接触抗生素，抗生素使其定向变异 预先已变，抗生素淘汰大量敏感型 变量实验 1943年S.E.Luria和M.Delbruck首先试验 自发突变发生越早，抗性菌落出现越多 噬菌体起到淘汰和甄别的作用,103cfu/ml,各皿间相差极大（0107） 各皿间数目基本相同,喷入等量T1噬菌体,基因突变的自发性和不对应性的证明,涂布实验 1949年Newcombe设计 这就说明，该抗性突变的发生是在未接触

15、噬菌体前，否则两组皿中菌落数应该相等,原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率 初始接种量：5 104 个/皿 培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌 这时，每个平皿上的细胞数为： 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6（2.61085104）=15.6108 在未涂布的平板上共发现28个突变，故 突变率 = 28/(15.6 108 )= 1.8 108,基因突变的自发性和不对应性的证明,影印实验 1952年J.Lederberg夫妇首先试验，在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充

16、分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用 平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时和其它研究中均有应用，值得很好地领会,微生物基因重组,原核微生物的基因重组 要获取国外的某些先进技术（部分基因）有哪些途径？,细菌亦然： 转化、结合、转导,工业间谍（地下工作者）的拿来主义,引进,合作开发,转化： 只有在亲缘关系较近的菌种间才能发生 接合 广泛应用于遗传学分析 转导： 1951年辛德尔和莱德尔格在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的,引进,感受态是细菌的特殊生理状态，其出现只维持几十分钟，是细菌在细胞表面产生出某种分解细胞壁的酶，CaCl2处理可使大肠杆菌易于达到

17、感受态,合作开发,大肠杆菌苏、赖AA营养缺陷型（B+M+T-L-）和大肠杆菌生物素和甲硫AA营养缺陷型（B-M-T+L+）的混合培养 U形管试验：只能让游离DNA通过不让细菌通过的滤板 电镜观察发现与性纤毛有关,工业间谍（地下工作者）拿来主义,超微烧结玻璃板：细菌不能通过，噬菌体可以通过,LA-2是能合成色氨酸（B+）但不能合成组氨酸（A）的伤寒沙门氏菌,LA-2是不能合成色氨酸（B+）但能合成组氨酸（A）的伤寒沙门氏菌,间谍,指导色氨酸合成的基因,能合成色氨酸,侵入、重组,转移、导手,诱发突变,物理因素，如260nm紫外线引起T-T的生成；X射线引起DNA理化性质的改变；电离辐射产生高活性自

18、由基，导致DNA分子变化,诱发突变,化学因素 烷基化试剂：与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA，与磷酸二酯键中氧作用使链断裂 亚硝酸盐与碱基环外氨基作用，引起碱基改变，如CU 碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰正常的复制和转录,其他诱变剂： 如卟啶染料等,5溴尿嘧啶,在疾病的诊断、治疗与预防中的应用,形态、结构、染色性、生化特性、抗原性及毒力等方面的变异，使得诊断复杂化 如金葡菌的耐药性菌株增加，菌落由金黄色变成灰白色，血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也成为致病菌，给诊断带来困难；伤寒沙门菌有10%不产生鞭毛，检查无动力，无H抗体，

19、影响正确判断。 耐药菌株日益增多，因此以药敏实验为指导 减毒菌株和无毒株可制备成疫苗,人工构建新菌株-诱变育种,选择好出发菌株 复合诱变剂的使用 剂量选择 变异菌株的筛选 作业：诱变菌株环保市场的开发前景如何? 市场调查：目前国内外哪些主要的此类公司?,制成单细菌悬浮液，为什么？如何分散？ 诱变剂与细菌充分接触； 培养液中加入玻璃珠，并保持振荡搅拌形成出发细菌的单细菌悬浮液（细菌、放线菌-108个/ml ；霉菌、酵母菌-106个/ml）,选择合适的诱变剂剂量 少，效率低； 过高“是药三分毒”会造成细菌大量死亡,如何筛选突变出的高效菌？ 选择性培养基,例如在进行细菌紫外诱变时，通常使用15或20

20、W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液1530cm，照射1520min,评价,诱变法潜力要远大于诱导法，但操作复杂。 在实际诱变中，往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体 最后这些突变体将会在实验室小试、中试的基础上被投放到生产实践中 参见 环境微生物学技术手册,人工构建新菌株-诱导育种,通常生产上更多利用的是诱导法 选育筛选与定向培育 筛选“众里挑一” 定向培育“教育培训” 定向培育在水的生物处理称驯化,污泥培养初期逐步提高污水比例，有些菌种不能适应被淘汰(筛选)，能产生诱导酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，且能力逐步提

21、高，使废水达到预期的排放标准,细菌的筛选方法,原理：休眠的酶基因复活+自然突变优胜劣汰 方式：选择性培养基（天然+人工） 天然特殊区域采样 如何筛选能降解石油的细菌？,筛选分离 选择性培养基（石油）浓度升高 待降解物通常为有机毒物或惰性物 筛选与诱导驯化可以同时进行 特点：操作简便，驯化的潜力有限，慢,1,4,驯化,2,3、4,小考,中考,高考,人工构建新菌株-人工基因重组遗传工程,遗传工程是70年代初发展起来的生物技术 定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。 工程：类似工程设计那样有很高的预见性、精确性与严密性,遗传工程的方法,遗传工程方法包括： 细胞水平（细

22、胞工程）：两个细胞原生质体融合 基因水平（基因工程） 狭义的讲，遗传工程就是基因工程 原理：限制性核酸内切酶,体 外 切 割 导 入 遗 传 物 质 基 因 片 段 受 体 细 胞,原生质体融合 遗传性状不同的两个细胞发生融合产生重组子 亲本的选择：适合于重组，适宜的遗传标记 原生质体制备：在等渗液中酶解细胞壁 原生质体的再生：在等渗的培养基中重建细胞壁，恢复细胞完整形态 原生质体的融合与融合子的检出 化学诱导法：聚乙二醇（PEG）及钙离子，在流动质膜之间形成分子桥 电融合法：瞬时电脉冲使两细胞接触处的细胞膜发生破裂,真菌纤维素酶 细菌溶菌酶,基因工程 载体条件： 是一个有自我复制能力的复制子 能在受体细胞内大量繁殖 最好只有一个限制性核酸内切酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上 须有一种选择性遗传标记，以便及时选择,在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌,质粒载体（具有抗性基因） 如抵抗青霉素,长出必是重组成功细菌,外源基因片段,遗传工程在环境工程中的应用,基因工程方法看似简单，但在具体实施上有较大的难度 细菌的质粒本身容易丢失或转移 质粒具有不相容性 深入学习： 使用哪些方法有利于不同质粒的相容? 国内那些科研院校进行基因重组工程菌的开发研究,只有在一定条件下，属于不同的不相容种群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中,基因工程安全防护 风险： 致