分子遗传学：基因诊断

1、基因诊断,Gene Diagnosis,疾病的诊断依据,实验室诊断技术： 细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验 基因诊断,临床表现,2,20:29,Opening Ceremony of the 2008 Beijing Paralympics on Sep 6th,2008,GJB2基因,线粒体基因突变（发生频率最高的为A1555G突变）,PDS基因,Sign Language Performance: Hello Star,多数耳聋患者都是遗传所致,We are different,4,20:29,生命特征都是由遗传决定的,遗传特性是相对的，而变异是绝对的,5,20:

2、29,几乎所有的疾病都与基因改变有关,Disease,6,20:29,?,?,?,?,7,20:29,一致的遗传信息,一致的表型？,英国同卵双胞胎命运迥然不同,20:29,8,奥利维亚和伊莎贝拉,相同的基因型,不同的表现型,基因表达模式,9,表观遗传学,9,20:29,表观遗传学的研究内容概 述,基因转录后的调控 基因组中非编码RNA 微小RNA（miRNA） 反义RNA 内含子、核糖开关等,基因选择性转录表达的调控 DNA甲基化 基因印记 组蛋白共价修饰 染色质重塑,10,20:29,主要内容,基因诊断的概念 基因诊断技术 基因诊断的应用,基因诊断的定义,采用分子生物学方法（核酸分子杂交、P

3、CR等技术）在基因（DNA）水平及转录水平对基因的结构和功能进行分析，从而对特定的疾病进行诊断，因此基因诊断至少包括DNA诊断和RNA诊断两大部分。,DNA诊断 检测特定基因的DNA序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况，及特定DNA的拷贝数。分析静态的基因结构。 RNA诊断 对待测基因转录物（RNA）进行定量，检测其剪接和加工的缺陷，以及外显子的变异等等。分析动态的基因表达。,12,20:29,意义 逆向诊断（reverse diagnosis）: 和传统的诊断方法主要差异在于直接从基因型推断表型，即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断，这样就改变了传统的表型诊断方式，故

4、基因诊断又称为逆向诊断（reverse diagnosis） 。 症状前诊断 预测疾病的易感者和检测携带者 产前诊断,13,20:29,基因变异致病的类型,内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、易位 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入,14,20:29,基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现： （一）影响其产物组成或结构 （二）影响其表达的量,基因突变改变表达产物的 “质”和“量”引起疾病,(一)基因突变改变表达产物组成和结构,同义突变 （cosense mutation）:基因突变只在非关键的部位发生，如在密码子第3位由于简并性而发生的并不会改变

5、氨基酸，也不影响其产物的生物学活性和性质,碱基置换突变,17,错义突变 (missense mutation) :碱基置换发生在密码子上，改变其相对应的氨基酸类型。 如果被改变的氨基酸位于多肽链的关键部分，如活性中心、催化中心或分子结合部位，则有可能改变这一产物的生物学活性和作用，改变的程度则视具体情况而定。,20:29,18,无义突变(nonsense mutation)：基因突变在本来不是终止密码处产生终止密码，即所谓，会使基因表达产生的多肽链缩短，失去或大大减弱肽链的功能。,20:29,终止密码突变（termination codon mutation）：突变在原来终止密码处产生非终止密

6、码，变成编码氨基酸密码，叫做则其表达产物多肽链会延长，也会失去或大大减弱正常多肽链的功能。,移码突变（frame-shift mutation）： 当基因核苷酸序列插入或丢失1个、2个或不构成三联体密码或其倍数的多个碱基后，在插入或丢失部位后面的三联体密码会发生移码，造成其表达的多肽链截短或延长，从而丧失或大大减弱正常多肽链的功能。,碱基缺失和插入突变,数目变异的串联重复 (Variable number tandem repeats),20,20:29,脆性x综合症就是由于三核苷酸（CCG）n重复序列的拷贝数增加所致,染色体易位 （Translocation）,21,20:29,Abnorn

7、al Processing of the Globin primary RNA Transcript,剪切位点的突变,22,20:29,有不少疾病基因本身并无突变发生，但调控疾病基因的基因发生了突变，这些突变可以发挥正调控作用，也可以发挥负调控作用，其产物通过改变疾病基因的表达程度而引起相应表型的改变。 如某些酶基因表达缺失或过量引起的遗传性疾病就是这种情况。,(二) 基因突变改变基因表达水平,Blood samples - the most widely used source of DNA from adults. Mouthwashes or buccal scrapes - being

8、 noninvasive, they are especially favored for population screening programs. Mouthwashes yield sufficient DNA for a few dozen tests, and by using whole genome amplification more extensive testing of a single sample may be possible. Chorionic villus biopsy samples - the best source of fetal DNA (bett

9、er than amniocentesis specimens). One or two cells removed from eight-cell stage embryos, for pre-implantation diagnosis after in vitro fertilization. Hair, semen, etc. for criminal investigations. Archived pathological specimens, for typing dead people when no DNA has been stored, or testing tumors

10、 for genetic changes. Only short sequences, 250 bp or less, can be reliably amplified from fixed tissue specimens.,Samples required for genetic testing,24,20:29,基因诊断的特点,高敏感性 高特异性 适用性强 早期诊断,25,20:29,Methods and techniques used in genetic testing基因诊断的方法和技术,Mutation scanning technologies (突变扫描技术) 未知突变

11、Mutation Screening technologies （突变筛选技术 ）已知突变 Fluorescent-energy transfer techniques,27,20:29,（荧光共振能量转移）,Polymerase Chain Reaction (PCR),Polymerase Chain Reaction,Kary Banks Mullis,Kary received a Nobel Prize in chemistry in 1993,Michael Smith,28,20:29,PCR,简单重复序列区间扩增,指数后线性扩增PCR技术,29,20:29,in situ PC

12、R,原位PCR是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原位PCR扩增，再进行DNA分子原位杂交的技术-细胞内基因的定位。,30,20:29,Nucleic Acid Hybridization 核酸分子杂交,31,20:29,核酸分子杂交 ： 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下,与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性,DNA:DNA,DNA:RNA,RNA:RNA,几种分子间杂交,Southern blot,Northern blot,dot hybridization,FISH: fluorescence in situ hybridi

13、zation,Nucleic Acid Hybridization,Southern blotting Southern 印迹杂交法,Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断等。,（其基本过程类似于上述Southern法） 提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记DNA或RNA）与之杂交显影或显色检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA,Northern blotting Northern 印迹杂交法,Mutation scanning technology突变扫描技术 未知突变,Complete gene sequencing Sin

14、gle-strand conformation analysis Denaturing gradient gel electrophoresis Heteroduplex analysis Denaturing High Performance Liquid Chromatography DNA chips GWAS,Scanning technologies aim to find unknown mutations in candidate or known disease genes.,36,20:29,Complete gene sequencing全基因测序,对已知基因组序列的物种进

15、行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。,37,20:29,全基因组测序支持治愈美国双胞胎多巴反应性肌张力障碍,墨蝶呤还原酶（SPR）,38,20:29,当SPR发生变异时，它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质五羟色胺和去甲肾上腺素的细胞途径。结果意味着双胞胎不仅缺乏多巴胺，还缺乏五羟色胺。,2014年1月人类基因组测序的花费降到了1000美元,Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象多态性分析 (SSCP),单链DNA片段在中性条件下形成复杂的空间折叠构象，这种立体结构依赖其内部碱基组成，当有一个碱基发生改变时，会影响

16、其空间构象，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。,39,20:29,Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象多态性分析 (SSCP),正常基因,突变基因,PCR变性,中性PAGE,+/+,-/+,-/-,杂合子,40,20:29,A,T,A,T,C,G,A,C,G,C,Heteroduplex Analysis 异源双链分析,由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者被分离开。,41,20:29,Denaturing H

17、igh Performance Liqid Chromatography DHPLC,变性的高效液相色谱检测,42,20:29,异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。,43,20:29,20:29,44,Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)变性梯度凝胶电泳,原理:双链DNA分子在一定变性剂浓度梯度的凝胶上电泳时,会在一定的时间发生部分解链, AT对较丰富的部位容易解链，错配的碱基部分更容易解

18、链，导致电泳迁移率下降 当正常的DNA分子和发生突变的DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异时,也会在不同时间发生部分解链,从而被分离成两条带,45,20:29,DNA变性： 解链: 错配碱基A/TG/C,DGGE,High melting domain,Low melting domain,DNA变性： 解链: 错配碱基A/TG/C,46,20:29,变性梯度凝胶电泳 (DGGE),GGGG,正常DNA分子,GGGG,突变DNA分子,PCR,GGGG,CCCC,GGGG,CCCC,GGGG,CCCC,GGGG,CCCC,正常DNA分子,突变DNA分子,凝胶电泳,增加变性条件,DNA变性： 解

19、链: 错配碱基A/TG/C,47,20:29,?,Gene Chip 基因芯片,基因芯片,又称DNA微阵列(DNA microarray），将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地高密度地排列固定于支持物上，制成基因微阵列,样品 DNA / RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 可对基因序列及功能进行大规模、高通量地研究。,48,20:29,DNA Microarray analysis of gene expression

20、,49,20:29,Gene Chip,50,20:29,Image of a DNA Microarray,51,20:29,Microarray-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH，基于基因芯片的比较基因组杂交技术）,52,20:29,Genome-Wide Association Studies （GWAS，全基因组关联研究）,是指通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记（如SNP或CNV等）分型，检测全基因组范围的遗传变异与可观测的性状之间的关联，从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法。,53,20:29,关联研

21、究是基于群体中无亲缘关系的病例组和表型正常的对照组在某一个遗传位点上会出现不同的频率而设计的。,全基因组关联研究,54,20:29, Francis Collins, 2008, Francis Collins, 2008,GWAS为全面系统研究复杂疾病的遗传因素掀开了新的一页，为我们了解人类复杂疾病的发病机制提供了更多的线索。,Mutation Screening technologies突变筛选技术,restriction fragment length polymorphism Allele-specific oligonucleotide hybridization Amplifica

22、tion refractory mutation system,Screening techniques aim to find known mutations, preferably with high throughput.,56,20:29,Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP, 限制性片段长度多态性 ),限制性内切酶片段长度多态性RFLP：该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列

23、变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。,57,20:29,Allele II 产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,58,20:29,Allele II 酶切位点消失,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb

24、,4Kb,probe,12Kb,8Kb,59,20:29,restriction fragment length polymorphism RFLP (限制性片段长度多态性 ),Schematic for RFLP by cleavage site loss,Analysis and inheritance of allelic RFLP fragments,Schematic for RFLP by VNTR length variation,60,20:29,Allele-specific oligonucleotide hybridizationASO (等位基因特异性寡核苷酸杂交),突

25、变探针,正常探针,杂交,突变基因,正常基因,调整杂交温度,61,20:29,Amplification refractory mutation system ARMS（扩增阻滞突变体系）,特点：灵敏、快速、简便，适用突变基因的结构、定位明确的样品。 能检出杂合子个体,野生型-野生型 突变型-突变型,野生型-突变型 突变型-野生型,野生型-野生型 突变型-突变型,62,20:29,Fluorescent-energy transfer techniques荧光共振能量转移,当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量、供体）的荧光基团传递

26、到长波长（低能量）的荧光基团。,63,20:29,64,20:29,Q,65,20:29,Real-Time PCR: the TaqMan Method,66,20:29,A schematic representation of SNP analysis by the TaqMan method,67,20:29,突变模板,正常模板,molecular beacon SNP analysis method 基于分子信标技术检测SNP,Molecular beacon will emit fluorescence once it meets the complimentary DNA of

27、the loop sequence,68,20:29,69,20:29,Application of gene diagnosis基因诊断技术应用,70,20:29,基因诊断的应用,用于遗传病诊断 用于肿瘤诊断 用于诊断感染性疾病 在器官移植组织配型中的应用 在法医学中的应用,71,20:29,对不同疾病采用不同基因诊断的策略,人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。 如：病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及与疾病有关的内源性基因。,72,20:29,2、对致病基因还没找

28、到，发生机制也没有完全清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的联锁遗传标记进行基因诊断。,对不同疾病采用不同基因诊断的策略,73,20:29,3、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通过基因表达的定量分析进行基因诊断。 对与基因表达异常出现的疾病，可以在转录水平上对该基因的表达的mRNA量进行分析，作出诊断。,对不同疾病采用不同基因诊断的策略,74,20:29,sickle cell anemia镰刀型细胞贫血病,75,遗传病直接接诊断,20:29,血红蛋白亚基,76,Mst： CCTNAGG,镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子对应的DNA序列,A：

29、CCTGAGGAG S： CCTGTGGAG,正常人,突变携带着,患者,镰刀型红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,S：,A,Mst： CCTNAGG,20:29,Cystic fibrosis 囊性纤维化,囊性纤维化跨膜传导调节因子,77,20:29,CFTR含1 480个氨基酸,遗传性外分泌腺疾病，主要影响胃肠道和呼吸系统，通常具有慢性梗阻性肺部病变、胰腺外分泌功能不足和汗液电解质异常升高的特征。,是一种cAMP依赖性氯离子通道，广泛分布于上皮细胞顶膜上。,ASO dot-blot analysis of CF mutations,78,20:29,DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床

30、症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。,DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）,79,Gene 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个Exon ，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa，分子量427kD。 DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。,20:29,Duchenne muscular dystrophy,80,20:29,DMD的基因诊断,DMD属XR DMD基因是最大的基因，有79个外显子 DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位,E1

31、,E2,E3,81,20:29,多重PCR扩增后电泳检测结果,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm 3 43 50 13 6 47 60 52,bp,535,113,82,20:29,遗传病间接诊断,当致病基因虽然已知，但其异常尚属未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和遗传标记的连锁分析间接地作出诊断。,83,20:29,多态性连锁分析,DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。常用做遗传分析中的标记。 DNA多态RFLP、VNTR、SNP 多态性连锁分

32、析： 应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断。,84,20:29,一) 限制性片段长度多态性,Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。,85,20:29,二)数目变异串联重复，variable number tandem repeats, VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次

33、重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR 散在分布于染色体上。 重复单位625bp长，称为小卫星DNA。重复单位26bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。短串联重复序列（short tandem repeats，STR） VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,86,20:29,Single Nucleotide Polymorphis

34、ms (SNPs，单核苷酸多态性）,单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生置换、颠换等变化，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。SNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点。,87,20:29,APKDGene定位16p13，已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,成年型多囊肾病(adult polycystic kidney disease)，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。,autosomal dominant polycy

35、stin kidney disease（ADPKD，常染色体显性多囊肾病）,88,20:29,以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交Southern Blot杂交,Gene组DNA,probe （3HVR）,DNA片段,杂交,结果,PvuII酶切,89,20:29,3.4kb,结 果,3.4kb,1,2,1,2,3,4,5,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.,90,20:29,多囊肾病的两个致病基因目前已被克隆，按照发现先后命名为PKDl和PKD2，功

36、能为维持正常肾小管形态发生和分化。 当PKD1或PKD2基因突变，引起PC-1（多囊蛋白-1）或多PC-2结构和功能异常，进而导致肾小管细胞内信号转导异常，正常肾小管形态不能维持，遂发生肾囊肿，进而引发多囊肾。,20:29,91,肿瘤的基因诊断,肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，无法采用统一的策略。,92,20:29,20:29,93,显示有BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%85%和15%45%，有BRCA2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%85%和10%20%

37、。,安吉丽娜遗传乳腺癌基因,感染性疾病的分子诊断,定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。 动态、定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据。,94,20:29,SARS相关冠状病毒的分子诊断,95,20:29,巢式PCR - Nested PCR,DNA Template,First PCR Run Majority of PCR Product,96,20:29,基因诊断在法医学上的应用,这孩子一点也不像我，是不是要去做做亲子鉴定？,是指应用医学和人类学的方法检测遗传标记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲子关系所作的科学判定。,98,亲子鉴定 (identification in disputed paternity),20:29,亲子鉴定悄然升温,现代亲子鉴定法,ABO血型检查 DNA指纹分析 STR技术应用,99,20:29,DNA指纹技术,多位点性 高变异性 简单而稳定的遗传性,“小卫星DNA”具有高度