第十三章荧光分析法

1、第十三章 荧光分析法 用荧光来进行定性定量的分析法荧光分析法 光照 分子基态 =激发态 辐射跃迁 荧光若光源是：可见一紫外光源分子荧光分析法 由荧光波长可确定物质分子具有结构 由荧光强度可测定物质含量原子特征光谱作光源原于荧光分析x射线作光源x射线荧光分析荧光分析法与可见紫外、红外比较：均属于分子光谱 荧光 可见紫外、红外本质 发射光谱 吸收光谱灵敏度 10-810-10g/ml 10-510-7g/ml 选择性 高 一般 但仪器价格昂贵第二节 基本原理一、 分子荧光的发生过程（1）荧光和磷光荧光：由第一激发态单线态的最低振动能级回到基态任一振动能级就发射的光谱。1、三线态：总自旋S=1，由自

2、旋，由多重性M=2S+1=3这样的分子受激后， 产生能级分裂，这受激态为三线态。单线态：总自旋S=0，两个电子自旋相反，M=2S+1=1解释：大多数分子偶数电子，基态时，这些电子存在于各个原子轨道，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于0（S=0），因此是抗磁性的其能级不受外界磁伤影响而分裂。这种电子能态为单线态，多重性M=2S+1=1。当基态分子的一个成对电子吸收光能而被激发的过程中，自旋方向不变，此时的激发态为激单线态。若一个电子在激了态上自旋方向有改变，即自旋方向相同，则分子中电子的净自旋等于1（S=1），这样的分子在磁场中受影响而分裂，M=2S+1=3，这种受激态为三线态。E： 跃迁 跃迁

3、单线态 单线态单线态 三线态（自旋方向改变）跃过几率：-1（若看作1） 10-6（光学禁阻、几率小）1、 荧光与磷光的产生：激发态基态 共四五条途径（若包括磷光产生）振动驰豫：（非辐射跃迁）从电子激发态的某一振动能级到达同一电子激发态的最低振动能级的过程为。发生在同一个激发态的电子能级上。P59，图14-1（b） 此过程反10-11-10-13秒， 荧光发射：电子由第一激发态单线态的最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而了射的光量于为荧光。（因可停在基态任振动能级上，得到的荧光谱线是几个非常靠近的峰值，进一步振动驰豫，很快回到V=0）若发射荧光几率高，发射过程快10-7-10-6秒说明一点：荧

4、光没长比激发波长要长，是因为返回基态是由第一激发态单重态最低振动能级，而在被激的电子由激发态单线较高振动能级最低振一时，已损失一部分能量（振动驰豫以热形式损失掉一部分）。P59图14-1（d） 内部能量转换：（非辐射跃迁）受激分子将能量转变为非量子化的热能而加到电子基态。第二电子激发态单线态第一电子激发态单线态基态单线态。 E0 E小P59图14-1（S2能级量好修正一下）第一电子激态S1的较高振动能级与第二电子激发态S2的低振动能及相重迭，内部转换易发生。10-1-10-13秒可完成。内部 ：内部能量转换后，分子通过一系列振动驰豫回到基态最低振动能吸。注意：尽管使分子激发的波长有长有短，但发

5、射荧光的波长是一样的。（同一物质而言），且荧光波长比激发波长长。三线态上两个激发态也会发生内部能理转换。 体系间跨越： 激发态单线态激发态三线态P59 14-1（e） 受激分子的电子在激发态发生自旋反转而改变多重性的过程与内部能量转换一样，当激发态的单线态S1最低振动能级与跨越后，荧光量子减弱甚至会荧光熄灭。例：含重原子（I，Br）的分子 自旋与轨道运动相互作用 易发生体系间跃迁，使荧光减弱甚至熄灭。 溶液中有O2 O2顺磁性物质 总之，处于激发态的分子可通过四个途径回到基态，具体有无荧光发生，要看后三种途径哪种速度快几率大。2、 荧光量子效率： 显然： 一般 3、 荧光与磷光比较：A荧光磷

6、光成因激发单线态最低振动能级基态单线态激光三线态最低振动能级基态单线态E 照射后发射时间 10-7-10-18秒 10-3-10秒共振荧光：当荧=激时的荧光为共振荧光。迟带荧光：处于激发三线态的某些分子还可以通过又一次体系间跨越回到激发单线态，继而再发射荧光回到基态。在室温下，磷光一般不易呈现，若安测磷光应在低温下，仪器应有低温设施。二、激发光谱与荧光光谱： 荧光发射各个方向都可测，为了防止透过示干扰，在其垂直的方向测荧光。1、激发光谱：（与吸收光谱类似）固定发射光波长发（即第二个单色固定），依次改变激发波长激测荧光强度F，以F-激作得荧光物质的激发光谱。P61图14-4虚线 P6214-52

7、、荧光光谱： 固定激发光波长激（即第一个单色器固色），依次改变发射波长发（即第二个单色器改变）测F、以F-发作图得荧光光谱。P61图14-4实践 P62 14-5（实） 荧光光谱上荧光强度最强的波长就是荧光发射波长。即电子回到基态时以发射这个能量的几率最大。 激发光谱上荧光强度最强时的波长作激发光源可得到强度最大的荧光。 实验测得荧光物质的激发光谱与紫外吸收光谱形状相似。是由于荧光物质吸收于这种波长的紫外光，才发射出荧光。吸收愈强，发射的荧光也愈强。区别在于吸收光谱测A，而激发光谱测F。，而有书则认为二者光谱一致，只不过以F代替了A即激发光谱是表观吸收光谱，经校正后可以一致。说明： 若荧光物质

8、的激光谱有两个或两个以峰时，不管使作哪个波长激发光源的波长，其荧光光谱的形状和峰高是相同的。 荧光光谱与激发光谱互为镜象。P62图14-5 葸 图14-6对应看懂 图14-1看懂则本章基本内容已掌握。激发光谱： E 荧光光谱 E b0：基态V=0第一激发态V=0 递 递 Co:1激发态V=0基态V=0递 递C0：1激发态V=0基态b1：基态V=0第一激发态V=1 增 减 C1： V=0 V=1 增 减b2：基态V=0第一激发态V=2 C2： V=2 V=2P6图14-5是高分辨仪器打击，所以可看出一高的峰。由此图可看出 像关系。A峰由图141解释：由S0S2（精细结构）思考：若分别选01，02

9、等做激发波长，能否得到类似的荧光光谱？答：可以。峰形、峰位相同，只不过F不同。原因发射荧光均由第一激发态的最低振动能级基态各。二、分子结构与荧光：1、 两个必备条件： 分子一定要能吸收紫外，可光见光及具有吸光结构。结构中有*，n*，而*引起是弱吸收，不足以发射荧光。故实际上发射发射荧光分妇应有*k带，尤其是共轭强吸收时，荧光产生。 有较高的荧光量子效率。2、 结构与荧光：（1）具有共轭双键和分子有利于发射荧光。 *，大，；*，小，小 电子共轭度增大，荧。 例：ex 激 205 268 356 nmem 荧 278 321 404 nmf 0.11 0.29 0.36 （2）平面刚性高的刚性结构

10、分子荧分子荧光强例（3）空间位阻：其实质仍为刚性共面问题。1-二甲基胺基-磺酸盐 1-二甲胺基-8磺酸盐=0.75 =0.03 (4)取代基影响：斥电子基团引入，9（-NH2，-OH，-OCH3等）吸电子基团引入，（-COOH，-NO2，-cl等）减弱轭体系。影响不大：-SO3H，-NH3+，-R二、影响荧光的外界因素：1、温度：低温，。（T分子运动加快，磁撞几率无辐射跃迁）例：某荧光物质乙醇液：O时以10，F3%，降至-80时，1原因：T，分子动能，非辐射失活。2、溶剂：溶剂介电常数，极性 n*,E, * E, 溶剂含量原子或溶液、溶解氧（CBr4,C2H5I等），体系间跨越。使，甚至熄灭。

11、溶剂粘度，F 3、pH的影响： 无荧光 兰色荧光 无荧光3、 荧光熄灭剂的影响：54、激光光的影响：光闸不能常开，与可见紫外不能常开不太相同，可见紫外是防止光敏元件损坏而此处主要防止样品分解。65、荧光物质浓度要稀，C时，偏离线性。76、散时光影响：Ray/elgh,Raman瑞利光：光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散解光为Ray/elgh,其波长与射光相同。拉漫光：光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变，这种光为 。两种散射的波长位置与荧光波长非常接近，常影响荧光纯度。由图，当有350nm激发时，400nm处的Raman

12、光被荧光掩盖而影响荧光纯度，有时还会使最大发射荧光波长产生偏移。而以320nm激发时，两散射光均不干扰。故：在测定时，安准确选择激发波长，即要产生最大荧光强度，又有能让荧光波长产生偏移。宁可牺牲一些荧光强度也要保证荧光纯度。如何选择激一荧： 激 选max激发光谱发 选max荧光光谱 激与发要有一定距离，避免溶剂散射光干涉。第三节 荧光定量分析一、荧光强度与浓度关系： 荧光强度F与溶液吸收光能和程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。 荧光强度F与被测物质吸收光的强度成正比。受激后，可在各个方向发射荧光在透过光的方向不易测定F。F=K，（I0-I）由Beer定律：=10-Rcl则：F=K，I0（1

13、-10-Rcl）= K，I0（1-e-2.3Ecl）将e*级数泰勒展开：有：F=K，I01-（1+）当浓度很小时，Ecl很小，当Ecl0.05时，级数中第二项以后可以忽略。F=K，I02.3ELC即：F=KC 条件：C小，使Ecl0.5，产生偏离。二、荧光分析灵敏度：对于荧光法FI0 I0 F FC只要检测器灵敏，可检测微弱信号。而对于分光光度法的吸收光谱，C极小时，I/I01 A0无吸收若C不变，改变射光I0，则无用吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。二、分析方法：1、 工作曲线法：（与可见紫外对照讲）C0 C1 C2 吸收曲线（可紫）找max 激发曲线（可紫）找 激 对照可见紫外： A

14、0 A1 A2 测F， 可紫外测A荧 光： F0 F1 F2 回归 测定2、 比例法：取已知量的纯净荧光物质配一标液，使浓度在线性范围内，测Fs。同样条件下测试样Fx(若空白液的荧光强度调不到0%时，应扣除空白F0。则： （F0后类似于可见紫外中A0应扣除）3、 校正仪器：选择某种标准溶液校正，如：硫酸奎宁（0.05MH2SO4）mg/ml其F值天天不变，用其调F100%（类似于pH要定位）。第四章 仪器一、荧光计主要部件：（与可见紫外对照）Vis.VV光源单色器样品池检测器记录荧光 光源单色器样品池单色器2检测器记录1、 激发光源：高压 365nm低压Hg灯，产生线光谱 254nm 氙灯，产生连续光谱250-700nm其中300-400射线强度几乎相同。2、 单色器：激发滤光片（第一滤光片）：在光源和样品池之间，将不需要的光滤去。荧光滤光片（第二滤光片）：在样品池与检测器之间，只让所发射荧光照射到检测器上。目前的荧光分光光度计，用光栅作单色器；光电荧光计用滤光片。3、 检测器：光电倍增管4、 样品池：低荧光的玻璃or石类制成，四面透光。二、荧光种类： 光电荧光计 荧光分光光度计激发光源 汞灯 氙灯激发单