核基质与现代医学专题八

1、专题八：核基质与现代医学1、核基质与肿瘤医学概述 核基质的研究经过20多年的发展,其研究内容远超出了形态学方面的分析。业已证明：活性转录基因优先与核基质相连；RNA合成和未成熟的RNA拼接位点锚定于核基质；细胞周期进行性调节元件与核基质结合；转录后修饰的蛋白激酶也与核基质相关；Merriman等研究核基质与骨钙素基因启动子的相互作用时发现，一种组织特异性的核基质蛋白NMP2可以和骨钙素基因启动子结合，从而调节基因的转录；此外，一些重要的抑瘤基因p53，pRb和瘤基因c-Myc的蛋白也是核基质结合蛋白。新近报道:细胞周期调节蛋白P21/WAF1/CIP1也是核基质结合蛋白。另外，一些DNA肿瘤病

2、毒蛋白HPV E7和EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3C也属核基质结合蛋白。这些资料表明，细胞内的许多重要事件与核基质密切相关。细胞发生癌变时，这些重要事件表现更为活跃，同时还伴有一些与肿瘤发生相关的核基质蛋白出现，这为寻找肿瘤特异抗原提供了一条新的途径。研究表明，细胞在癌变的过程中，其核基质及核基质蛋白会发生形态和生化上变化。这些改变必将导致DNA的拓扑结构及基因与核基质相互作用的改变，相应的改变会反作用于癌变的过程，从而引起一系列相关的连锁反应。由于核基质蛋白本身具有组织特异性，而且这种特异性在癌变后的细胞中更为明显。因此对核基质蛋白的深入研究有助于建立新的肿瘤检测

3、技术和治疗方法。近年来，活性核基质蛋白成分、结构和功能在肿瘤发生、演进中的作用一直是研究的热点问题之一。目前的研究主要集中在以下四个方面：1. 核基质蛋白与肿瘤的发生；2. 核基质蛋白与肿瘤的演进和转移；3. 核基质蛋白与肿瘤病理诊断；4. 核基质蛋白作为肿瘤化疗的靶标。1.1、核基质蛋白与肿瘤的发生癌基因的激活和抑癌基因的失活在肿瘤的发生中起重要作用。抑癌基因p53和它的类似物p73可以结合于核基质。DNA损伤后，这种结合增强。p53和核基质的相互作用可以被F-肌动蛋白调节。抑癌蛋白pRb在细胞增殖和分化的调节中起关键作用，也是一种核基质相关蛋白。核基质蛋白Lamin A与pRb结合，可防止

4、pRb被蛋白酶降解。研究发现， 15%以上的肿瘤有病毒性因素。整合于肿瘤细胞的病毒基因位于MARs的附近，然而非病毒性肿瘤的基因变化却和这些区域没有显著的相关性。在食管癌、子宫颈癌等，人乳头瘤病毒E6E7癌基因存在于核基质相关DNA中。整合于宿主细胞的病毒基因可通过MARs控制转录调节，进而引起病毒性肿瘤。 1.2、核基质蛋白与肿瘤的演进和转移 肿瘤的重要特征是演进和转移，也是肿瘤预后不良的重要原因。Spencer等利用乳腺癌进展过程的各阶段系列细胞系，通过双向凝胶电泳对核基质蛋白质和顺铂在原位与DNA产生交联的蛋白质进行了分析，发现乳腺癌的演进与结合于细胞核DNA的NMPs的改变相关。在结肠

5、癌的肝转移中，Brunagel等发现3种在结肠癌出现的核基质蛋白，也出现结肠癌肝转移的癌组织中，但在正常肝组织和肝细胞中不出现。这些蛋白显示了结肠癌肝转移的特殊性，可能在肿瘤转移中起重要作用。在具有不同转移潜能的黑色瘤细胞系中，EGFR基因片断紧密结合于核基质，它们的结合与黑色素瘤细胞系WM451和WM35具有不同的转移潜能相关。 1.3、核基质蛋白与肿瘤病理诊断 肿瘤病理诊断的主要指标是核形，异常的核形可以看作癌细胞的重要病理特点。核基质是有活力的RNA-蛋白网络，在决定核型方面发挥作用。通过这一蛋白网络，它可以组织染色体结构，参与复制和转录。进一步的研究发现，参与转录、染色体修饰和选择性剪

6、切的蛋白酶在核基质上有特殊的结合位点。核基质具有组织和细胞的特异性，并且与细胞的转化和分化状态有关。目前，人们已从结肠癌、膀耽癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等癌组织或细胞中分离并鉴定出数种与特定组织癌变相关性核基质蛋白成分，核基质蛋白作为肿瘤标志物已经得到认同，成为判断疾病状态的一个有用指标，其中的NMP22已用于膀胧癌的临床诊断。 1.4、核基质蛋白作为肿瘤化疗的靶标肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，因此肿瘤的治疗也涉及到许多因素。抗癌药物可通过多种机制来干扰肿瘤细胞的生长和生存。有些抗癌药物发挥细胞毒作用的一个重要机制就是诱导细胞核的损伤，在核基质水平上诱导细胞死亡。研究表明核基质的多种结构和

7、功能单位可能是某些药物的作用靶点。例如DNA拓扑异构酶II活性药物、烷化剂、离子射线等抗癌药物均优先与核基质靶蛋白相互作用，这也是这些药物发挥抗癌效应的关键之一。正常细胞随机用烷化剂处理时，MARS及其附近的DNA会被选择性的破坏。某些抗代谢药物及抗拓扑异构酶活性药物则主要抑制核基质相关酶的活性。早幼粒细胞白血病蛋白PML是核基质相关蛋白，形成PML核体，具有内在的抗病毒活性，抑制肿瘤的生长、参与造血祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等。在急性早幼粒细胞白血病中，t(15,17)的易位可以形成由核基质蛋白、PML和维甲酸受体所形成的融合蛋白，PML核体被破坏。当用全反式维甲酸诱导分化或被A

8、s2O3引发凋亡时，PML核体可以重新形成。PML与泛素化相关肤Sumo-1相结合，这一过程可被As2O3加强，正是由于PML与核基质的相互作用。综上所述，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理并发现肿瘤治疗新的药物靶点。2、核基质与癌基因、抑癌基因核基质与肿瘤的关系也十分密切，一些与肿瘤发生相关的病毒、癌基因和抑癌基因蛋白是核基质蛋白或核基质结合蛋白，癌基因和抑癌基因产物是在核基质结构上发挥作用。SV-40 T与p53、HPV E7 与pRb、pRb与c-Myc、p53与WAF1/cip1等的相互作用也是在核基质网络上进行。2.1、癌基因

9、产物与核基质的关系研究表明:v-Myc和c-Myc蛋白与核结合有三种类型:a、低盐和高盐抽提去除DNA和RNA的细胞残核保留了大部分(60%90%)的Myc蛋白；b、完整的细胞核在低盐缓冲液中经核酸酶消化DNA可释放1%的Myc蛋白；c、用低盐和去污剂抽提却得不到10%的Myc蛋白。显然，用制备核基质的高盐方法所得的抽提物含有大量的Myc蛋白，这些Myc蛋白与单链和双链DNA具有亲和性。经盐和核酸酶抽提的细胞残核用抗Myc蛋白抗体的荧光分析显示：Myc蛋白是与复杂的残留核结构核基质相结合。 用分离的HL-60核基质与32P末端标记的c-myc片段进行结合的实验表:c-myc瘤基因的MAR可与H

10、L-60细胞株的核基质蛋白结合。经不同的方法抽提核基质后，Myc蛋白仍与核基质牢固结合。尽管在细胞周期中c-Myc蛋白水平无明显的改变，但是，这种核基质结合的c-Myc蛋白在S期比G2期更高；免疫电镜也证实c-Myc的信号在核基质中比在未分步处理的细胞核中更强，c-Myc蛋白与核基质网络更易结合。以上资料说明：c-Myc瘤蛋白是一种核基质结合蛋白，它与细胞核基质的结合与其功能密切相关。 在肿瘤细胞中癌基因egfr 通常表达或高表达。Egfr 的表达在肿瘤发生发展中发挥重要作用。目前封闭EGFR治疗肿瘤已成为一个研究热点。封闭EGFR行使功能的策略有:下调EGFR表达，阻止EGFR活化和/或磷酸

11、化，抑制EGFR下游信号传导。Chew等研究了胶质母细胞瘤和黑色素瘤细胞株中egfr 基因与核基质的关系，他们的研究表明细胞恶性程度越高，egfr 基因与核基质的结合越紧密，而且egfr基因的非编码区(相当110 bp片段)与核基质结合的紧密程度大于编码区(相当于939 bp片段)。他们还发现egfr基因与核基质的结合与黑素瘤细胞的转移能力有关：转移能力高的细胞株中egfr基因的940 bp片段与核基质的结合强度大于转移能力低的细胞株。 应用免疫组化和Western印迹方法证明TCA8113中高表达EGFR，而且通过核基质DNA的PCR扩增，发现TCA8113细胞中egfr基因的两个片段均与核

12、基质结合，当DNase浓度加至100 g/ml，这两个片段仍能扩增出阳性片段，说明在该细胞中egfr基因的这两个片段与核基质蛋白紧密结合，即使应用数10倍DNase I(完全消化核基质上DNA的浓度)的量，也不足以将与核基质结合的egfr基因片段降解。说明核基质蛋白能够很好地保护这部分egfr DNA片段不被DNase I消化。活性表达的基因通过一部分基因片段与核基质相结合，通过核基质蛋白来调控与之相结合的基因 2.2、抑癌基因产物与核基质的关系 研究得较多的抑癌基因是p53、pRb、p21/WAF1基因。它们的产物都是细胞核基质结合蛋白，其共同点是参与细胞周期和细胞生长的调节，三者协同作用，

13、有效地控制细胞生长。 2.2.1、 p53 通过制备Meth-A(甲基胆蒽转化细胞)或SV-40转化细胞的核质、染色质和核基质，分析p53与这三种细胞核亚组分的关系时发现：在Meth-A细胞中，p53在代谢上变得稳定；在SV-40转化细胞中，p53与T抗原形成复合物后也显稳定，p53均与Meth-A和SV-40转化细胞染色质和核基质结合。进一步分析了p53与DNA相互作用的结果表明：mt(mutant type)p53和wt(wild type)p53以及重组后的杆状病毒在昆虫细胞中表达的wt p53均可与DNA片段结合。p53与DNA相互作用的特征提示：p53也应与核基质或MAR-DNA结合

14、。 根据以上结果，提出一种模型：p53通过与MAR元件结合并参与程序性的DNA复制和基因表达的调节。另外,wt p53和mt p53可能对复制区MAR-DNA结合产生不同的作用，它一方面抑制wt p53的活性,另一方面又引起了mt p53的活化。mt p53以类似wt p53蛋白的方式与MAR-DNA结合，但是这种mt p53缺乏与SV-40 DNA的GGGCGG相同序列结合的能力。因此，p53突变并不影响DNA结合，而是有选择地干扰了它与个别DNA元件的结合。mt p53与MAR-DNA的结合具有特异性、高亲和性、和所涉及的MAR/SAR-DNA与mt p53的结合区域。mt p53的MAR

15、/SAR(scaffold attach region)的结合区定位在两部分，高突变的核心区和C端的60个氨基酸残基部位，并带有非特异性DNA结合区和寡聚区。mt p53与MAR/SAR元件的相互作用可能干扰了核内的重要事件，因此产生了多效性的致癌作用。这种作用是因为MAR元件构成了染色质结构与功能的重要的更高层次的调节元件，以致改变肿瘤细胞的表型。或许，mt p53是一类新的癌基因的代表，它通过长距离地改变或干扰染色质结构和功能来发挥作用。 2.2.2、 pRb Mancini等研究表明：一部分低磷酸化的pRb只是在G1早期与核基质结合，肿瘤细胞中的mt pRb却不能与核基质结合，而重组Rb

16、的细胞含有大量的核基质结合的pRb蛋白；pRb广泛地分布在整个核基质内，尤其是浓集在核周和核仁残骸上，核基质的纤维颗粒上却检测不到pRb。他们筛选了潜在的pRb结合蛋白的表达文库，证明有几个克隆是核基质部分的，特别是核纤层蛋白Lamin A和C在体外可与pRb结合。因此，他们提出，pRb与核基质的相互作用对它调节细胞周期进程的功能来说是重要的。与pRb蛋白羧基末端相互作用的多个细胞蛋白相反，Durfee T等(1994)用双杂交系统筛选，仅分离到与氨基末端片段相关的一个克隆。这个基因编码一个新的核蛋白，其表观分子质量为84 ku。与pRb相似，84 ku核蛋白在检测的组织和整个细胞周期中均表达

17、。实验还证明：84 ku蛋白在亚核区域浓集，并参与RNA加工，与许多参与转录、拼接机制的蛋白相似，p84是一种核基质的成分。体内、体外的实验证明：p84优先和具有功能活性的低磷酸化形式的pRb结合。 2.2.3、 p21/WAF1LEC大鼠肝损伤与肝脏铜的异常累积有关。在LEC大鼠肝细胞中，p53和p21/WAF1的表达明显增高并显示较低生长活性。用低铜喂养LEC大鼠可明显地降低p53和p21/ WAF1的表达；在用高铜喂养的大鼠肝细胞核和核基质做免疫印迹分析时发现：p21/WAF1蛋白在LEC大鼠肝的核基质中清楚地检出，核基质部分可富集p21/WAF1约200倍。这表明低铜可大大地降低p21

18、/WAF1的表达。p21/WAF1是一种核基质蛋白或核基质相关蛋白。不同剂量的铜饲喂养的LEC大鼠诱导p53和p21/waf1表达的同步升高或降低，提示这两种抑癌蛋白在核基质结构上协同发生作用。综上所述，我们可以看出，与肿瘤发生密切相关的癌基因产物癌蛋白是核基质结合蛋白，c-Myc癌蛋白是在核基质结构上起作用。在细胞周期的不同阶段，c-Myc癌蛋白与核基质的结合量有所改变。三种主要的抑癌蛋白p53、pRb、p21也属核基质结合蛋白。有趣的是，p53与SV-40 T抗原、pRb与HPV E7、pRb与c-Myc、p53与p21/waf1之间的相互作用也都位于核基质。核基质在细胞转化和肿瘤发生的D

19、NA复制、RNA转录、基因调控过程中起着一个“操作台”的作用。它把肿瘤病毒蛋白、癌蛋白和抑癌蛋白富集在核基质上，从而提高了相互间的作用效率 。3、核基质与肿瘤病毒随着有关细胞恶变分子机理研究的兴起，近年来，人们把注意力集中到亚核结构核基质上，有关核基质与细胞恶变的关系逐渐被揭示。大量的研究表明,核基质与肿瘤病毒的作用关系密切。3.1、核基质在细胞恶性转化过程中的变化及其作用 通常核基质的组成反映细胞的表型及分化状态。恶性转化会引起这些细胞特征发生变化。最近的一些研究表明，某些肿瘤细胞里存在一些正常细胞所没有的核基质蛋白。在浸润性导管癌里发现了几种正常乳腺组织所没有的恶变特异性核基质蛋白；前列腺

20、肿瘤中发现了一种正常前列腺组织或良性肥大所没有的核基质蛋白。另外，有报道说在结肠腺癌的标本里存在6种正常结肠组织没有的核基质蛋白。Alber等在研究核基质中间丝复合体(NM-IF)与前列腺癌的关系时，用双向电泳及Western印迹分析前列腺癌的NM-IF，检测到肿瘤相关蛋白，NM和IF都有明显变化，低分化前列腺癌中几种细胞角蛋白(CKs8,18和19)含量下降，其表达显著低于正常前列腺和良性前列腺增生，有趣的是，它甚至还明显低于中高度分化的前列腺癌。此外，还检测到分子量为48,000的肿瘤特异性多肽，核基质蛋白随着分化水平高低而逐渐变化，低分化的肿瘤组织中有新的蛋白出现，这些结果提示肿瘤的发展

21、过程出现和肿瘤相关的核基质蛋白。Brancolini等报道了一分子量为190 Kd的核基质蛋白，其在正常组织及V-myc转基因NIH3T3细胞中表达，而在V-src、V-fos、V-ras转基因NIH3T3细胞株中表达减弱，提示核基质蛋白与细胞转化有关。 视黄酸(RA)是维生素A衍生物，它可引起生长抑制，以及使终末分化的胚胎性癌细胞系(NT2)变成有丝分裂后期的中枢神经系统神经元。利用PCR研究RNA指纹时检测到一种富含丝氨酸/苏氨酸的异常蛋白质，即RA调控的核基质结合蛋白(RAMP),其在RA诱导的NT2细胞分化中表达下降。成年人的胎盘、睾丸及其它的胎儿组织中都可检测到RAMP的mRNA表达

22、，RAMP的转录表达与NT2细胞的增殖密切相关，RAMP的过度表达会引起NT2细胞的增殖率短暂升高，说明RAMP在胚胎性癌细胞的增殖中扮演重要角色。一些核基质蛋白(NMPs)有组织和细胞特异性，并随着细胞的转化及分化状态不同而改变。因而可作为恶变程度的标记物。NMPs已被试用于检测膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌及以头颈部肿瘤。在分析乳腺癌细胞系时发现其NMPs发生了特异性变化。有研究证明乳腺癌细胞恶变过程伴随着染色质和NMPs结合的减少，而在核周边部的核纤层及中间丝蛋白则和DNA结合增加。NMPs在乳腺癌的发病研究中被用作生物标志物，研究人员分析了雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系(包括MCF-7

23、、MIII、LCC1及LCC2)的核基质蛋白，发现它与乳腺癌恶变过程的不同阶段相关。用双向电泳法分析核基质蛋白，发现与DNA结合的核基质蛋白发生特异性变化，显示乳腺癌的发展伴有染色体结构改变，从而导致基因表达的变化。 MAR对胚胎组织的转基因的表达有积极的作用，但对成熟的组织作用甚微，细胞的分化状态和增殖率可能和MAR有关。HET/SAF-B是一种结合MAR的核基质蛋白，具有抑制热休克蛋白基因转录的效应。同时,也发现它是雌激素受体基因表达的阻遏蛋白，雌激素受体、核基质蛋白和热休克蛋白的异常表达都与乳腺肿瘤发病有关。Towhson等在研究中发现HET/SAF-B的水平和细胞增殖率呈反比，并对HE

24、T/SAF-B在细胞增殖分化中的作用机制进行了探讨，证明HET/SAF-B对乳腺癌的发生有着重大影响。 3.2、核基质与肿瘤的发生、发展 核基质的变化不仅反映恶性表型，而且还涉及到恶性发展的过程，最好的证据来自于肿瘤病毒学。病毒癌蛋白具有三个共同的特征：转化细胞、对核基质的高亲和性、与视网膜母细胞瘤抑制蛋白pRB的低磷酸化特异结合。至今这组转化蛋白包括SV40 T细胞抗原、腺病毒E1A蛋白、人类乳头状瘤病毒蛋白E7。 16型人类乳头瘤病毒(HPV-16)的E7蛋白引发了人们对核基质研究的极大兴趣，因为在16型乳头瘤病毒转化的CaSki和SiHa宫颈癌细胞系里，21KDa E7蛋白是完全结合在核

25、基质上，而其它的病毒蛋白则分别与几种细胞核成份结合。E7在核基质内的定位是通过显微镜免疫染色，Western印迹法及免疫沉淀法检测出来。宫颈癌细胞中所有能被检测的E7都定位在核基质上。人类乳头瘤病毒中致癌的E7蛋白和E6蛋白均是细胞转化所必需。就象其它的结合核基质的病毒转化蛋白，E7癌蛋白与肿瘤抑制蛋白p110RB牢固结合，这提示p110RB也可能是和核基质结合。Mancini等的研究证实，在不含乳头瘤病毒的CV-1细胞中，低磷酸化的p110RB在细胞周期G1早期便结合在核基质上。在G1早期，正是低磷酸化的p110RB能把细胞周期中止在G1期，且能和核基质稳定的结合。此外，低磷酸化的p110R

26、B还会与乳头瘤病毒E7癌蛋白结合。随着细胞周期的进程，p110RB变成高磷酸化不再与核基质结合。人们认为G1早期E7和p110RB的一些重要反应都是发生在核基质上。 此外，还发现其它的一些与p110RB结合的核基质蛋白，其中最具特征的是Durfee等用双杂交筛选的一种84Kd的蛋白(P84)，p84与p100RB的氨基末端结合,抽提后p84仍完全保留在核基质内，且主要位于核的拼接区。在G1期p84能把一些p100RB片段浓集在拼接区。E6和E7的表达受E6基因上游的启动子控制，在HPV-16里称之为p97，一般认为，p97控制转录的强度将决定原位E6和E7癌蛋白的浓度，癌蛋白浓度的高低对致癌过

27、程会产生不同的影响，而p97的活性又受两种MAR的影响。HPV-16 p97的活性受转录激活蛋白和阻遏蛋白调控，此调节蛋白和一550bp大小的DNA片段相结合，而这个DNA片段正好位于两段MAR之间，一段位于长控制区(LCR含增强子和启动子)5端，另一段MAR则与E6基因的编码序列重迭在一起。病毒转染细胞时，增强子和启动子与MAR结合后其转录可被抑制。 为了研究它们的功能，研究人员把这两种MAR和嵌合基因连结在一起，嵌合基因含有HPV-16的增强子启动子片段以及一段报告基因。在转染Hela细胞时，这两种MAR对报告基因的表达有很强的抑制作用。为了研究与抑制作用有关的蛋白结合位点，他们用电泳迁移

28、率转变试验(EMSA)分析了所有代表这些MARs序列的重迭寡核苷酸。这些MAR都含多个针对两个强结合蛋白的结合位点，其它蛋白的结合点则比较少。其中最强的结合蛋白在每个MAR上至少有5个结合位点，它是由CCAAT错配蛋白(CDP /Cut)产生。CDP/Cut是一种阻竭蛋白，它在细胞分化时水平下调,但对未分化的上皮细胞和Hela细胞里的HPV-16转录有明显的抑制作用。CDP/Cut还可阻止MARs和核基质发生转录有关的反应。另一研究发现SATB1和CDP/Cut均能和一种位于肿瘤病毒启动子中的MAR结合并抑制它。在缺乏DNA结合位点的情况下，SATB1和CDP/Cut则相互结合而失去抑制作用，

29、因此，只有当核基质中没有SATB1和CDP/Cut结合位点时才会出现肿瘤病毒转录。 HPV-16 MAR整合到宿主细胞染色体时可能把病毒基因插到核基质区，消除CDP/Cut的抑制作用而促进转录过程，导致E6和E7瘤蛋白的高表达。在恶变地区HPV-16基因更多是整合到染色体中而不是以游离的形式存在。HPV-16 MAR具有转录增强子作用，并激发依赖染色体整合的HPV-16瘤基因的表达，在宫颈癌的多步骤致病过程中起作用。最新的研究表明，病毒蛋白的保守区域对它的转录和转化功能非常重要。而这段保守区的许多功能又与核基质密切相关。核基质可能是肿瘤转化过程中发生结构功能变化的重要靶的。在病毒转化细胞过程中

30、，微小DNA肿瘤病毒SV40的主要转化蛋白(肿瘤大T抗原,1arge T)会特异地结合到染色体和核基质上。在微小DNA肿瘤病毒引起的良性损害过程中，病毒基因组通常位于染色质外，而恶性变时，病毒DNA则整合到宿主细胞染色质中。为了研究病毒DNA整合在肿瘤发生中的作用，他们分析了整合病毒基因在肿瘤细胞中的位置，这些肿瘤病毒有人乳头状瘤病毒、乙肝病毒、SV-40及I型人T细胞白血病病毒。其结果显示病毒整合于瘤细胞的MARs序列附近,而非肿瘤细胞里的病毒整合与MARs没有明显关系。提示整合肿瘤病毒基因是属于MARs介导的转录调控，这一结果为阐明病毒的致癌机制提供了一种新思路。 细胞恶性转化的过程非常复

31、杂，常导致有关基因和表型的变化。正常的基因转录过程遇到了损伤会及时得到修复，如果基因发生了突变，则转录的修复就会有缺陷。而这种突变往往是相关蛋白迅速易位到核基质上所产生的。一些与肿瘤发生相关的病毒、癌基因和抑癌基因蛋白是核基质蛋白或核基质结合蛋白。SV-40 T与P53、HPV E7与pRb等的相互作用也是在核基质网络上进行。有理由相信，核基质的研究不仅可用与肿瘤的早期诊断，还可研制出针对核基质的抗肿瘤药，其特异性强，对周围组织几乎无副作用，必将为肿瘤的研究带来新希望。 4、核基质与肿瘤标记物 核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)具有组织细胞特异性及肿瘤相关性

32、。细胞癌变过程中NM及NMPs发生剧烈形态和生化变化，NM变化必将导致DNA拓扑结构及基因与核基质相互作用的改变，必将引起癌变过程中一系列连锁反应。细胞核大小和形状的改变是肿瘤病理诊断的主要依据，细胞核形态则主要依靠核基质来维持，细胞核形态的改变必将伴有NMPs的特异性改变。NMPs不仅参与染色质组成、DNA复制、转录和基因表达等一系列核内重要事件，而且还具有组织细胞特异性和肿瘤相关性，随着NMPs这一肿瘤标记物研究的不断深入，其必将为肿瘤的诊断、治疗、预后乃至肿瘤发病机制的阐明提供重要的理论和实验基础。4.1、核基质蛋白与肿瘤诊断 近年来研究表明，核基质蛋白与肿瘤的关系十分密切。在多种肿瘤如

33、膀胱癌、白血病、前列腺癌、食管癌、肝癌等癌细胞中都发现存在着相应的特异性核基质蛋白，其可作为肿瘤临床诊断学的补充，有些还是确诊肿瘤的重要依据。 4.1.1、 前列腺癌在针对前列腺癌核基质蛋白的研究中发现，前列腺癌细胞中不仅存在特异性的核基质蛋白，而且这些蛋白成份还会随着肿瘤的病情的发展而变化。研究发现，正常大鼠前列腺组织和Dunning R3227前列腺癌培养细胞NMPs双向电泳图谱明显不同，其中10个蛋白点仅存在于正常组织中，3株前列腺癌培养细胞(G、AT-2、MLL)均缺失；同时又有3个蛋白点仅表达于上述3株前列腺癌细胞中，正常组织则未见表达。另外，各株细胞系间其NMPs也不尽相同，非浸润

34、性、非转移性细胞株G发现两种相关蛋白，而转移性细胞株AT-2和MLL也存在2种特异蛋白。人前列腺正常组织、增生组织及癌组织NMPs双向电泳分析发现，3种组织间存在14种NMPs差异表达，其中分子量为56 kD的PC-1特异存在于癌组织中，前两者组织则未见表达。PC-1单克隆抗体PRO:4-206的免疫组化分析表明，22例前列腺癌组织阳性率为85%，前列腺增生及正常前列腺组织阳性率分别仅为9%和5%，PC-1显示了较强的肿瘤特异性。同时,蛋白免疫印迹证实PC-1是核仁磷酸素(nucleophosinin)，为一种RNA结合核磷酸蛋白，主要表达于强活性增殖细胞中。不同病理分期的人前列腺癌组织NMP

35、s也具有差异性表达，其中YL-1(76kD)特异性存在于所有预后差的组织中，10例预后好的组织仅有3例表达，中间组10例有9例弱阳性表达，正常前列腺组织则无表达，表明该蛋白和前列腺癌恶性程度高度相关 4.1.2、 乳腺癌乳腺正常组织及癌组织和癌细胞系MCF-10 NMPs的双向电泳表明，大部分NMPs为三者共有，其中4种蛋白仅表达于乳腺癌组织及MCF-10细胞系中，正常组织则无表达；相反，有2种蛋白仅表达于正常组织中，癌组织及MCF-10两者均无表达。结果提示这些肿瘤特异性NMPs在细胞癌变过程中作用重大。乳腺特异性NMPs多克隆抗体NM200.4免疫组化结果显示乳腺癌细胞核NM200.4强阳

36、性表达,正常组织着色较淡；多非整倍体细胞其NM200.4相关抗原表达量明显高于二倍体或单非整倍体细胞，NM200.4显示了较强的肿瘤特异性。Yanagisawa等发现一分子量为114 kD的NMPs，其仅表达于49例乳腺癌组织中，毗邻的正常组织未见表达；该蛋白也不表达于纤维瘤、纤维囊性病及乳腺非典型增生等良性病变组织中。该蛋白业已证实通过结合至基质结合区(MARs)以发挥功能。 4.1.3、结肠癌Keene等研究发现有6种蛋白仅存在于18例结肠癌组织中，正常组织则全无表达；另有4种蛋白存在于正常组织中，而肿瘤组织未见表达。也有人以结肠癌NMPs为抗原，制备了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞克隆(N

37、o39、54、58)，该3株单抗均能很好地和结肠癌NMPs特异性反应，尽管抗体浓度高时，正常组织也存在交叉反应，显示了一定的肿瘤相关性。 4.1.4、头颈部肿瘤核基质组成和功能改变是头颈部肿瘤重要的致病机制。研究发现，有2种NMPs仅表达于喉癌组织及喉癌细胞系Hep1中，对照组正常喉腔上皮则缺失；舌部原发性癌及转移性癌和正常舌组织NMPs的双向电泳分析也发现，有4种蛋白仅表达于癌组织中；另有4种NMPs表达于口腔肿瘤中，正常对照组织则不表达。McCaffery等也发现11种NMPs仅存在于头颈部鳞癌中，正常鳞状上皮未见表达；相反,正常鳞状上皮有4种特异性NMPs表达，癌组织则无表达。 4.1.

38、5、 宫颈癌最近研究表明，核基质变化在宫颈癌发病机制中也具有重要作用。Keesee等从NMPs组分方面对宫颈癌进行了研究，结果发现5种NMPs(CvC-1 69.40kD，CvC-2 53.752kD，CvC-3 47.88kD，CvC-4 46.006kD，CcC-5 44.864 kD)仅存在于20例癌组织中，10例正常组织无表达；宫颈癌相关NMPs单抗NMP179免疫组化研究显示，低分化鳞癌(HSIC)96.7%阳性表达，高分化鳞癌70.5%阳性，但正常或良性病变组织仅见29.6%表达。该单抗对低或高级别宫颈内皮癌敏感性为79.3%，特异性为70.4%。由此可见，NMP179可能是宫颈癌

39、早期病变的敏感标记物。众所周知，人类乳头瘤病毒16(HPV 16)和宫颈癌高度相关。HPV 16基因组与特异性NMPs亲和力对比分析发现，HPV DNA容易和正常宫颈上皮细胞两种碱性高分子量NMPs结合；肿瘤细胞中，HPV DNA则和两种酸性低分子量NMPs漂移结合。上述研究表明，不仅正常和肿瘤细胞中NMPs组成具有差异性，而且肿瘤相关NMPs的DNA结合活性也不尽相同。因此，肿瘤相关NMPs在病毒DNA整合、翻译及细胞恶变等诸方面具有重要的调控作用。4.1.6、 骨肉瘤 Bidwell等研究成骨和骨肉瘤培养细胞NMPs，发现除共同表达的NMPs外，两者还存在特异性差异表达。其中Protein

40、 6(40kD)仅表达于正常二倍体成骨细胞中，而大鼠(ROS17/218)和人骨肉瘤细胞均无表达；结果还揭示，有5种主要蛋白具有肿瘤特异性或含量显著性增加，其中Protein 1(180kD)和Protein 2(92kD)具有肿瘤特异性和增殖依赖性，Protein 3(72kD)、Protein 7(35kD)及Protein 8(38kD)具有肿瘤特异性和增殖非依赖性。 4.1.7、肝细胞癌原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,尤其沿海地区为HCC高发区，但HCC的确切发生原因及发病机理仍不清楚。肝细胞癌组织NMPs双向电泳研究发现有两种NMPs具有肿瘤特异性，其中蛋白HCC

41、-1(62kD)存在于所有14例癌组织中，HCC-2 (33.25kD)有9例阳性表达。正常组织及Hep G2细胞系无表达。结果揭示肝癌也存在肿瘤特异性NMPs。进一步研究表明，肝癌中特异性存在一分子量为62kD，等电点为4.0的富集酸性NMPs，有趣的是蛋白序列分析证实该蛋白即为“钙网蛋白”(calreticulin)，肝癌细胞核中可见其准确核定位。结果揭示钙网蛋白2核基质同细胞增殖活性密切相关。4.1.8、 肾癌1998年Konety等以肾癌根治术癌组织和正常组织为材料,结果发现有5种特异NMPs (RCCA-1 53kD，RCCA-2 32kD，RCCA-3 27kD，RCCA-4 20

42、kD，RCCA-5 15kD)仅存在于肾细胞癌中，正常组织则未见表达；另有RCNL-1(100 kD)仅表达于正常组织中，癌组织无表达。上述结果在肾癌细胞系CA-498及769-P也得到了验证，显示了较强的肿瘤特异性。4.1.9、 膀胱癌Getzenberg等研究发现，17例膀胱癌组织中均存在6种肿瘤特异性NMPs (BLCA-1 72kD，BLCA-2 40kD，BLCA-3 39kD，BLCA-4 37kD，BLCA-5 32kD，BLCA-6 31kD)表达，而毗邻的正常膀胱组织及器官捐献者正常膀胱组织均未见表达；同时，有3种NMPs(BLNL-1 70kD，BLNL-2 66kD，BL

43、NL-3 60kD)特异性表达于正常组织，癌组织则无表达。蛋白序列分析证实BLCA-4同两种无脊椎动物蛋白具有同源性，但功能不详。现已制备出抗BLCA-4的单克隆抗体，该抗体免疫印迹显示癌组织及癌周“正常组织”可见阳性条带表达，器官捐献者正常膀胱组织则未见阳性条带；免疫组化结果显示了准确的肿瘤细胞核定位。另外，该抗体酶标免疫检测试剂盒可以检测尿液中的BLCA-4，尽管该实验有一定的低背景水平，但特异性为100%，敏感性为96.4%。如果这样高的特异性和敏感性能够被大样本临床实验所证实，那么BLCA-4很有可能成为特异性最强的肿瘤标记物而进入临床应用。另外动物实验也证实膀胱癌任何时期均有BLCA

44、-4表达，不管肿瘤的来源、级别和病理分期如何，该蛋白均能释放至尿中而被该抗体免疫测试盒检出，这是BLCA-4作为新型肿瘤标记物另一特点。膀胱癌高表达的另一NMPs是核有丝分裂元件蛋白NuMA，酶联免疫分析表明，膀胱癌核抽取物中该蛋白浓度是正常膀胱上皮的25倍。NMP22是NuMA的组分之一，肿瘤细胞死亡后该蛋白被释放至尿中。膀胱癌患者尿中NMP22浓度比健康对照组高10倍多。有关研究表明，该试剂盒敏感性是68%；特异性为80%。也有报道，其敏感性几乎100%，特异性为85%，虽然对照组尿细胞学检查特异性为100%，但敏感性仅有31%。该检测方法不仅简便、经济，而且为非创伤性检查，几乎可以代替或

45、结合尿细胞学检查用于膀胱癌的诊断及术后复发监测，具有潜在的应用价值。尽管文献报道NMP22具有较高的敏感性和特异性,但有些学者认为,由于NMP22是NuMA的组分之一，也存在于正常组织细胞等所有细胞中。因此事实上并非所有尿NMP22升高就意味着膀胱癌复发，NMP22升高也见于尿路炎症、肾移植及其它泌尿系损伤病人。 4.1.10、NMPs与白血病目前白血病的病因与发病机制尚未被阐明，但近年来的研究发现白血病细胞与正常骨髓细胞相比，其核基质蛋白成分存在差异。结果发现，正常骨髓细胞与急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞白血病慢性期、急粒变期及化疗前后白血病细胞的核基质蛋白均存在不同程度的差异。虽然目前还没

46、有找到与白血病相应的高特异性核基质蛋白，但许多研究都明确表示白血病细胞与正常骨髓细胞的核基质蛋白存在着明显的差异。其主要表现为4点:出现新的核基质蛋白；核基质蛋白的含量有所增加；白血病细胞发生核基质蛋白缺失；化疗可以纠正白血病细胞核基质蛋白成分的改变。4.1.11、 NMPs与食管癌食管癌是世界上最常见的食管上皮恶性肿瘤，在西方国家，食管腺癌的发病率近年不断上升，而在发展中国家鳞癌则占绝大多数。由于缺乏适合的预防、筛查措施，大部分病人发现时已是晚期或有转移，临床治疗效果相当有限，5年生存率不到10%。食管癌的发病率有明显的地区差异，我国是全世界食管癌发病率和死亡率最高的国家，每年约有25万新诊

47、断的食管癌病例，占全世界食管癌病例数的一半；食管癌病人的死亡率居癌症死因第4位，严重威胁人民生命健康。目前普遍认为食管癌是多因素作用，多基因参与，多阶段发展的病理过程，然而其发生和发展的确切机制仍未阐明。研究表明,一种核基质蛋白类视网膜母细胞癌结合蛋白-8(similar to retino-blastoma binding protein 8，STRBP-8)在人永生化食管上皮细胞癌变过程中出现了差异表达。通过双向电泳、MALD-I TO F-MS、RT-PCR、克隆测序等方法对STRBP8进行研究，发现STRBP8可在食管癌细胞SHEEC中表达, 因此推测这些蛋白在永生化细胞转化为癌细胞的

48、过程中起重要作用，这一发现说明STRBP8有望作为检测食管癌的一个潜在的早期诊断标志物。4.1.12、其它肿瘤食管癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌及直肠癌等肿瘤组织均分别发现各自相关NMPs的存在。4.2、NMPs与抗癌治疗核基质蛋白作为核基质的主要成分，同时也是染色质/体的重要成分，因此将核基质蛋白看作治疗肿瘤的突破点成为许多科学工作者的设想。近来研究结果显示，核基质蛋白是许多化疗药物的作用位点，例如烷化剂和电离辐射主要是通过和NMPs及NM结合DNA相互作用机制来抑制肿瘤细胞生长的。染色体组装成NM结合DNA环为细胞核功能所必须，因而NMPs参与抗癌药物作用就并不奇怪。许多核基质结构和功能单位

49、可能就是抗癌药物作用靶位点。核基质蛋白除了作为化疗的作用位点外，这些特异性的蛋白还可以是许多靶向药物的靶点。事实上，现有的许多化疗制剂是在NM水平发挥其抗肿瘤作用。烷化剂和电离辐射主要是通过和NMPs及NM结合DNA相互作用机制来抑制肿瘤细胞生长；另外一些化疗制剂如拓扑异构酶活性药物可以特异性作用于DNA引发酶及DNA拓扑异构酶异构酶等基质结合酶，以抑制这些酶活性，致使肿瘤细胞死亡。由于传统治疗肿瘤的手段对身体的危害相对较大，所以近年来对靶向治疗肿瘤的药物研究也越来越多，而这些具有特异性的核基质蛋白无疑是一个合适的靶点，这对于有效治疗肿瘤提供了新的途径。 4.3、NMPs 与肿瘤预后众所周知，

50、肿瘤生物行为同肿瘤细胞核形态和结构异常密切相关，细胞核明显异常的肿瘤远比胞核变化不明显的肿瘤恶性程度高。而细胞核的大小和形状主要由NM决定，NMPs是NM的重要组成部分。因此有理由相信，光镜下低分化和高分化肿瘤细胞核的差异必然包容了NMPs差异表达。核基质蛋白除了可以为肿瘤的诊断提供信息外，同时核基质蛋白还可以指示肿瘤病情的恶性程度。因为核基质蛋白除了具有肿瘤相关性外，在不同的肿瘤时期，其表达程度有所不同。 研究表明，浸润性膀胱患者比非浸润性疾病高表达NMPs，这一发现说明膀胱癌患者体液中NMPs高表达可能和恶性肿瘤的生物学行为相关；Samuel等研究证实分化好乳腺癌和分化差乳腺癌NMPs存在

51、特异性差异表达，其NMPs可作为预后因子；前列腺癌研究也表明YL-1强表达于预后差肿瘤，而预后好的前列腺癌则弱表达。研究表明，NMP22除了可以作为膀胱癌的检测指标外,其在尿液中的浓度变化可以反映膀胱的病情。Lekili等和Shariat等研究均显示,尿液中的NMP22浓度随着肿瘤分级、分期的增高而增高。辛殿祺等在对642例膀胱移行细胞癌患者进行尿液NMP22检测，其得到的结果也表明尿液中的NMP22与膀胱移行细胞癌的病理分级、分期相关。Lakshmanan在研究前列腺癌时，根据患者的预后情况将其分为(预后差、一般、好)3组。经高分辨率的双向电泳研究特异性NMPs时发现，在预后差的实验组中均出

52、现一种特异性核基质蛋白YL-1，预后好的实验组中仅有一个样本出现YL-1，而在正常的前列腺组织中YL-1则无表达。由此可见YL-1与前列腺肿瘤恶性程度相关，可以作为前列腺癌预后的生化指标。还有，在浸润性膀胱患者比非浸润性患者高表达NMPs，这一发现表明膀胱癌患者体液中NMPs高表达可能与恶性肿瘤的生物学行为相关。 4.4、NMPs在肿瘤预防中的应用对付肿瘤的最好方法是预防，但是许多肿瘤病症在发病前期是没有明显症状的，难以检测。Konety等在分析了不同分期的膀胱癌鼠模型中BLCA-4的表达情况时发现，BLCA-4在形态学可检测到肿瘤形成之前就已经出现。这说明BLCA-4可能是膀胱癌的早期标志物

53、，甚至早于癌症的发生前已经出现。Konety再在分析脊髓损伤患者尿液的BLCA-4时发现脊髓损伤患者中有部分患者尿样中的BLCA-4水平高于临界值。患有脊髓损伤时由于导尿及同时并存的慢性刺激和炎症而成为患膀胱癌的高危群体，其发病率为0.39%10%，相比正常人脊髓损伤患者患膀胱癌的风险要高出460倍。 Konety等用免疫测定法检测了51例正常控制组受试者、55例膀胱癌患者和202例脊髓损伤患者尿样中BLCA-4的水平。通过评估BLCA-4水平与膀胱癌患者肿瘤分期、分级、尿细胞学、膀胱癌病史的关系, 比较了脊髓损伤患者与BLCA-4有联系的参数，如脊髓损伤持续时间、导尿、泌尿道感染、吸烟和尿培

54、养情况。结果表明正常控制组受试者的尿样中BLCA-4水平低于临界值，膀胱癌患者中有53例，脊髓损伤患者中有38例的尿样BLCA-4水平高于临界值。因此在脊髓损伤患者的尿液中检测到BLCA-4可预示其患上膀胱癌的可能性。这意味着BLCA-4可以用于膀胱癌高危人群的筛选和监测。4.5、展望虽然目前许多肿瘤还没有找到其相应的高特异性NMPs，但NMPs在肿瘤研究方面具有很好的应用前景。在肿瘤组织和细胞中寻找高特异性NMPs只是第一步。我们最终目的是根据寻找出来的高特异性NMPs作为靶点，从而设计相应的靶向药物以达至有效杀伤肿瘤的目的，或者直接将高特异性NMPs作为药物作用位点。除此以外，可通过深入研

55、究NMPs来揭示NMPs成分、结构、以及功能的改变在肿瘤发生发展过程中的作用，以此来研究肿瘤的发生发展机制。NMPs在不同种肿瘤以及相同肿瘤的不同病理阶段中表达有所差异，说明NMPs与肿瘤的发生发展、演进转移、诊断治疗之间存在一定的相关性。NMPs的种属特异性和细胞特异性，决定了其与肿瘤关系的复杂性，还有许多尚待深入研究的问题。进一步深入了解NMPs在肿瘤中的地位和作用，将为阐明肿瘤的发生发展机制，并为诊断和防治肿瘤疾病提供新的理论依据。5、核基质与肿瘤蛋白组学 蛋白质组(proteome)是细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学(proteomics)是研究蛋白质组的一个新领域，它以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。 恶性肿瘤发生过程包括许多基因突变从而导致蛋白质的表达、结构和功能改变，最终导致细胞周期失控，细胞凋亡能力下降，细胞浸润转移能力加强。蛋白质组学可以分析、鉴定肿瘤细胞的蛋白质分子变化，为肿瘤的预防、诊断治疗及预后提供极有价信的信息。由于差异表达蛋白质组学在制药和疾病研究中的巨大潜力，更是倍受重视