食用菌育种学 第四章 诱变育种

1、第四章 诱变育种,第一节 诱变育种的试验设计和准备工作 第二节 诱变育种的步骤与方法 第三节 突变株的分离与筛选 第四节 营养缺陷型菌株的筛选,概念：选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促使其突变率显著提高；采用简便、快速和高效的筛选法筛选出少数符合育种目的的突变株来供生产实践与研究应用。 目标：提高有效产物的产量 改善菌种特性、提高产品质量 简化工艺条件 开发新品种,诱变育种的目标及用途,诱变育种的目标及用途,青霉素产生菌选育历史,第一节 诱变育种的试验设计和准备工作,微生物,正变株,诱变育种,高产菌株的缺陷： (1)孢子数量减少 (2)生活周期延长 (3)可能发生回复突变,负变株

2、,发生概率大,诱变的不可预测性,高产突变型菌株是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的： 1. 这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变 2. 高产菌株产量的提高，是多代诱发突变积累的结果。只有那些每次诱变后有12个控制产量的基因突变，使产物合成稍有增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌株才能生存下来。 3. 高产菌株的环境适应能力差，育种时必须注意调整环境条件。,诱变育种的复杂性,1. 在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。 2. 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为710天的抗生素菌种来说，一代诱变需23月，因此事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征和生化特征

3、，以及有关培养条件对其影响等，最后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。,诱变育种的注意事项,诱变育种工作的三个主要环节： 1. 诱发突变 出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素等 2. 突变株的筛选 筛选条件(培养基和培养条件)、便捷的筛选方法等 3. 最佳环境条件的调整 突变株最佳培养条件的确定,诱变育种的主要环节,1. 区分不同菌落类型,1.1 诱变前对出发菌株的了解,2. 出现不同菌落类型的原因 主要原因：遗传因素 由遗传因素造成的不同类型菌落是一种变异现象，属不同遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代。 其它原因：非遗传因素，如培养基组成或培养条件的改变等 非遗传因素产

4、生的“变异”是一种假变异，不能遗传；菌种重新移回原来的培养基和培养条件，形态可恢复原状。,为了研究遗传因素引起的不同菌落类型，应尽量避免非遗传因素引起的菌落形态变化，以免鱼目混珠、干扰试验结果。,1.1 诱变前对出发菌株的了解,1. 多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。 土霉素产生菌斜面孢子培养34天好于910天 2. 研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性。 头孢霉素产量与孢子大小和数量成正比.,1.2 菌种特性与生产性能关系,1. 培养基 2. 培养基斜面制备技术 3. 移种的密度 4. 温度 5. 湿度 6. 药品和原材料

5、质量,1.3 影响菌种生长发育的主要因素,了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系 建立一个准确、简便、快速检测产物的方法 研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件,1.4 对其它条件的了解,第二节 诱变育种的步骤与方法,诱变育种的原则,挑选优良易诱的出发菌株 处理均匀的单胞或孢悬液 选择简便有效的诱变剂 选用最适剂量及作用时间 充分利用致变剂的协同效应 寻求可见的选择性相关指标 设计高效筛选方案与方法,诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，最大缺点是缺乏定向性。因此，除了深入开展诱变机制研究外，在诱变育种过程中应注意:,野生菌株:产量低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突

6、变率高； 最好是由生产育种中的自发变异株 采用具有有利性状的菌株 考虑选择己发生过其他变异的菌株 选择增变菌株的变异株以堤高致变敏度 选取能累积少量所需产物或前体物菌株,2.1 出发菌株,1. 对一般出发菌株的要求,1. 选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株 2. 选择纯种作出发菌株 3. 选择出发菌株应考虑其稳定性 4. 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株,2.1 出发菌株,2. 对出发菌株的具体要求,2.1 出发菌株,4. 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株,2. 对出发菌株的具体要求,5. 选择出发菌株的其它因素 6. 采用多出发菌株(3-4个) 7. 菌种代谢特点,2.1

7、出发菌株,2. 对出发菌株的具体要求,一般丝状菌的野生菌株多数为异核体，如果菌种背景复杂，用诱变剂处理后的变株中，负变率将增加。因此，微生物菌种选育之前的出发菌株和新变种获得之后，都要进行自然分离，即菌种纯化。 常用的纯化方法有划线分离法和稀释分离法；若仍达不到要求，则需采用显微镜操纵器分离单孢子，培养形成单菌落，得到纯菌株。,2.2 出发菌株的纯化,1. 供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 细胞生理活性方面既要同步，又要处于最旺盛的对数期。 对于细菌来说，常常通过前培养达到要求。 对于丝状菌来说，制备菌悬液时力求90以上为单孢子，并务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。 菌悬液的孢子或细菌数

8、可用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。 制备菌悬液通常采用生理盐水，如果用化学诱变剂处理时，则应采用相应的缓冲液配制。,2.3 单孢子(或单细胞)悬液的制备,2. 菌悬液制备方法 (1) 细菌 采用同步化的预培养方法：,2024h 培养的新鲜斜面,基本培养基 3537振荡培养至对数期,6培养1h ，使之同步生长,加入适量嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养2060 min,低温(2)10min,离心洗涤,制备菌悬液,含玻璃珠三角瓶振荡10min,菌体计数，调整浓度,过滤,2.3 单孢子(或单细胞)悬液的制备,(2) 产孢子菌类 处理材料是孢子，而不是菌丝。,成熟而新鲜的孢子,液体培养基 振荡

9、培养至孢子刚刚萌发,振荡打碎孢子团块,离心洗涤,菌体计数，调整浓度,过滤,加入缓冲液,2.3 单孢子(或单细胞)悬液的制备,2. 菌悬液制备方法,1. 诱变剂种类的选择 (1) 选择诱变剂 (2) 根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 遗传稳定的:先强后弱; 遗传不稳定的:先选优良出发菌株,后温和诱变 (3) 参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂,通常做法：取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的测定，作出生产能力分布状况，然后分别统计它们的正突变株、负突变株和稳定株的频率。,2.4 诱变剂及诱变剂量,2. 最适诱变剂量的选择,(2) 最大形态变异率

10、的剂量不一定是诱发正变的最适剂量。,(1) 使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。,2.4 诱变剂及诱变剂量,(3) 诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌率高(9099)，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少；但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。,2. 最适诱变剂量的选择,2.4 诱变剂及诱变剂量,3. 诱变剂种类和剂量选择的一般原则 (1) 经长期诱变后的高产菌株，采用低剂量处理； (2) 遗传性状不太稳定的菌株，宜采用较温和的诱变剂和较低的剂量处理； (3) 要求筛选具有特殊性状的菌株，或较大幅度提高产量的菌株，可用强诱变剂和高剂量处理； (4)

11、诱变史短的野生低产菌株，开始时采用较高剂量，然后逐步使用较温和的诱变剂或低剂量处理； (5) 多核细胞菌株，采用较高剂量更合适。,2.4 诱变剂及诱变剂量,第三节 突变株的分离与筛选,筛选的发展趋势： 随机乱向筛选 定向筛选 突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子”。 筛选根据主次分为初筛和复筛 初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。 复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株。,3.1 诱变育种的基本环节,1. 常规筛选程序,3.2 诱变育种的基本环节,2. 简便筛选程序,3.2 诱变育种的基本环节,1. 随机筛选 即摇

12、瓶筛选 优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。 缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑取少，很难筛选到理想的突变株。 2. 平板菌落预筛 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。 几种具体方法,3.3 分离和筛选,A. 根据形态筛选变株 B. 根据平板菌落生化反应筛选变株 C. 采用冷敏感菌筛选抗生素变株:先低温后高温培养.,3.3 分离和筛选,2. 平板菌落预筛,D 浓度梯度法 E 应用复印技术快速筛选变株,3.3 分离和筛选,2. 平板菌落预筛,F.琼脂块大通量筛选变株 优点1

13、：判断活性圈准确 所有菌落限制在同面积琼脂块上，避免相互干扰； 每个菌落的产物都在相同体积的琼脂块中，避免扩散造成的误差。 优点2：大幅度增加筛选量 不足：培养条件与发酵条件有较大距离，易漏筛 解决办法：制备琼脂块用发酵培养基,3.3 分离和筛选,2. 平板菌落预筛,摇瓶培养通常分为初筛和复筛。 初筛时菌株较多，常用锥形瓶或大号试管摇床培养； 复筛时一个菌株重复35个试验瓶，以提高重演性；必要时还可采用两种以上的培养基进行筛选，以防漏筛。 摇瓶筛选实际上是各变异株之间的对比试验，有关摇瓶的各种条件要力求一致。,3.4 摇瓶液体培养,1. 琼脂平板活性圈法 2. 纸片法:发酵液浓度高时 3. 琼

14、脂薄层纸片法 4. 自动生化仪器分析法,3.5 产物活性测定,(水解酶、有机酸）,（产酸菌）,（工具菌+待检菌）,（抗生素）,表型=基因型环境 改变环境条件（调整培养配方和培养条件），使变株得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，,3.7 培养基和培养条件的调整,第四节 营养缺陷型菌株的筛选,营养缺陷型(auxotroph)：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 原养型(prototroph)：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。 筛选营养

15、缺陷株时，与之有关的培养基有三类： 1. 基本培养基(minimal medium, MM) 2. 完全培养基(complete medium, CM) 3. 补充培养基(supplemental medium, SM),1.诱发营养缺陷型: 亚硝基，亚硝酸，紫外线 2.淘汰野生型菌株 (1) 抗生素法(以青霉素为例) (2) 菌丝过滤法 (3) 高温杀菌法,4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选,3. 营养缺陷型的检出 (1) 点植对照法,(2) 影印法 注意事项： 加入0.5脱氧胆酸钠或在MM中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖可使菌落小而紧密； 改进操作，克服孢子扩散而带来的不纯现象。,4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选,主要筛选方法归纳示意图,4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选,4. 营养缺陷型的鉴定 (1) 鉴定方法 一个平皿中加入一种营养物质以测定生长因子需求情况。 生长谱法：在同一平皿上测定许多种生长因子的需求情况。 (2) 营养缺陷型鉴定步骤 缺陷型类别的测定 a: 氨