输血前配合性试验技术.ppt

1、输血前配合性试验技术,主要内容,一、ABO和Rh血型鉴定 二、抗体筛选和鉴定 三、交叉配血试验 四、抗人球蛋白试验 五、血小板输注前的抗体检测及配合试验 六、血浆输注前配合试验,输血风险,血型定型是基础 目的：准确定型，选择相容血液 意义：输血安全、有效,一、ABO和Rh血型鉴定,1.ABO定型 最适的反应温度为4，但在室温反应良好，常规的ABO定型试验仅在室温进行,红细胞常规ABO定性,血型 正定型 反定型 抗 A 抗 B Ac Bc Oc A + - - + - B - + + - - O - - + + - AB + + - -,鉴定方法介绍,1）玻片法、试管法(经典方法) 玻片法和试管

2、法的实验原理基本相同，二者的共同点是操作简便，玻片法只做正定型,试管法进行ABO血型鉴定的正定型和反定型。 缺点：操作不易自动化、批量化、结果不易保存,2）微柱凝胶法 过滤介质为颗粒直径26-103 nm的葡聚糖100凝胶，凝胶间缝隙只允许游离红细胞通过，与抗 体反应的红细胞不能通过。 工作程序和结果的判读易于标准化，自动化。该实验方法还具有所需标本少、结果准确、抗干扰能力强、溶血和脂血影响少、重复性好等优点，有利于实验室的质量控制，提高工作效率,微柱凝胶法结果,3）PCR血型基因分型 包括PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)技术、 PCR-SSO(PCR-序列特异性寡核苷酶探针)技术、P

3、CR-SSCP(PCR-单链构象多态性)技术、基因芯片等,基因分型技术的应用： 疑难血型鉴定：ABO 血型亚型的鉴定、血型抗原减弱个体的血型鉴定、抗体消失的血型鉴定、获得性B的鉴定等 直接抗人球蛋白试验阳性的患者血型鉴定 亲子鉴定及法医应用等,4) ABO血型的流式细胞术检测 方法和原理是用荧光素标记人源抗-A、抗-B 单克隆抗体，与待测标本中的红细胞反应,然后用流式细胞术检测待测标本中细胞与抗-A、抗-B 单克隆抗体的结合情况 成本高、操作复杂,非常规方法 利用流式细胞术对孕妇血流中微量的胎儿红细胞进行检测可以实现非侵入性胎儿血型鉴定,抗原抗体比例：一般认为增加抗体量能提高检测敏感性，极少有

4、显著性抗体过量而抑制凝集反应者（前带现象）。2滴血清+1滴 2%5%红细胞必要时血清增加到1020滴 前带现象：一种抗原-抗体反应的现象。以定量抗原检测抗体，若抗体过剩，可使所形成的免疫复合物反而减少，而不出现凝集,盐水试验多采用立即离心法,正确的操作是红细胞悬液加到血清后立即离心并观察结果。反应时间过长而延误立即离心的时间对ABO血型系统的抗体检出影响较大。 如果在室温放置2分钟后离心,可能使凝集减弱,并伴有溶血现象。 如果在室温放置5分钟后离心,原有的凝集可能消失,并有溶血,常规定型试剂要求,第一、高度特异，只能与相应的红细胞抗原发生凝集 第二、抗A血清效价在1：128以上，抗B血清效价在

5、1：64以上 第三、亲和力要求抗体和抗原发生的速度应在两者相加后15秒内出现凝集，其强度为3分钟时凝块不小于1mm2 第四，冷凝集素效价在1：4以下,ABO定型试验中的常见问题,1）技术和管理错误：标本、试剂、 器材原因；离心力过度或不足；阳性反应产生溶血现象未能识别；漏加试剂、结果记录和判断错误；细胞与血清间比例不适当。 2）血清异常：Wharton胶或血清蛋白引起缗 钱状形成，影响反定型结果。 3）红细胞致敏：受免疫球蛋白致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。 4）异常基因型：ABO亚型的检查中，A、B抗 原可能为弱抗原，难以检出,5）近期输血：试验前输入ABO血型不一致的红细

6、胞，使血液标本成为混合血型的红细胞悬液，定型时显示“混合外观凝集”现象。 6）嵌合体血型（开米拉，chimerism）:这种血型者体内有两类红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”现象。 7）疾病因素导致抗原减弱：某些白血病患者和难治性贫血患者等。 8）红细胞多凝集现象：红细胞因遗传或获得性的表面异常，发生多凝集现象,9）获得性B：由于革兰阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。 10）血型特异性物质过高：一些卵巢囊肿病例，血型物质的浓度很高，可中和抗A和抗B定型试剂，要得到正确的正定型结果，必须洗涤红细胞多次。 11）近期内进行大量的血浆置换治疗：由于使用大量的非同型的血浆作置换治疗，

7、造成反定型错误。 12）异常的血浆蛋白：受检者血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例和高浓度的纤维蛋白原等导致缗钱状形成，造成假凝集现象,13）不规则抗体的存在 14）低丙种球蛋白血症:低丙种球蛋白血症（丙种球蛋白量减低）病例，可能会因免疫球蛋白水平下降而使血清定型时不凝集或弱凝集反应。 15）药物等因素：药物、右旋糖酐及静脉注射某些造影剂引起红细胞凝集或类似凝集。 16）年龄因素：免疫系统尚未健全的婴儿、由母亲被动获得抗体的婴儿，或抗体水平下降的老人，试验时可出现异常的结果。 17）防腐剂因素,正反定型不符的解决,正定型中意外阳性或阴性的解决办法： 加入自身对照 增加血清/细胞比例 降低孵育温度,延

8、长孵育时间 4 /22 /37 15min-30min 镜检 洗涤红细胞 用不同来源的抗体试验 用人源性试剂作吸收放散(并作相应对照,反定型中意外阳性或阴性的解决办法： 血清和筛选A1细胞阳性、A2细胞阴性、自身阴性：可能是含有抗A1的A或AB型 部分筛选细胞阳性、自身阴性：血清中含有意外抗体,用一组谱细胞,确定抗体特异性 室温盐水反应抗体：MN、P、Lewis 排除冷抗体及缗钱状凝集 排除多凝集,正反定型不一致的思考及解决,1）首先考虑人为因素和试剂因素。 重新采集血样，核对试剂、离心条件等 2）分析可能导致正、反定型不一致的原因 3）针对性试验验证,ABO正反定型不符病例分析,抗A 抗B

9、抗A,B Ac Bc Oc 2 4 4 3 2 2 分析：患者血型可能是B型，体内有冷凝集素。 输血：确认血型之前可输O型洗涤红细胞，确认后输B型红细胞,ABO正反定型不符病例分析,抗A 抗B 抗A,B Ac Bc Oc 4 4 2 4 2 分析：患者的血型可能是A型。 巨球蛋白血症或部分多发性骨髓瘤患者，血液中异常球蛋白升高，导致缗钱状凝集。 输血：A型红细胞、血小板,ABO正反定型不符病例分析,抗A 抗B 抗A,B Ac Bc Oc 4 2 4 3 分析：患者血型可能是A型，获得性B。 核对患者诊断，进行相关试验。 输血：A型红细胞,正反定性不符病历,正定型 反定型 抗A 抗B 抗A1 A

10、c Bc Oc 4+ - 4+ 1+ 2+ - 患者 王某 女 60岁 低蛋白血症，重度贫血。抗体筛选使用聚凝胺法、 抗人球法均阴性 ，显示血型正反定型不符。结果有待PCR基因分型进一步确认。患者5月27日Hb 50g/L，情况差,当日给予输注配合的O型洗涤红胞2U，于5月28日再次检测Hb达69g/L，显示红细胞输注有效,正反定型的意义,准确的血型判定利于指导临床用血 发现亚型 抗原强度的改变与疾病相关 新抗原出现与疾病相关 排除假阴性或假阳性结果干扰,美国FDA分析了19761985年间输血导致的死亡原因，发现ABO血型错误输血导致的死亡占总死亡数的51。而这种错误一般都是责任事故，基本没

11、有技术原因，主要与管理有关,2Rh血型鉴定,Rh血型鉴定方法 1)盐水法 常规检测RhD抗原,单克隆RhD诊断试剂IgM 2)抗人球蛋白法或酶介质法 Rh抗体属IgG类，一般不能在盐水介质中与红细胞发生凝集，IgM型抗体盐水介质阴性时，必须加做IgG型抗人球蛋白法或酶介质法 3)微柱凝胶法,D抗原决定Rh是否阳性。 Rh阴性分布频率：白种人1520% 中国人 0.4% 中国汉族0.34% 大约1/3的Rh阴性的人，经Rh阳性抗原 免疫后，不产生抗D,Rh血型抗原的免疫原性 Rh血型抗原的抗原性强度可能仅次于A和B抗原，Rh血型抗原中的免疫原性强弱顺序为 D E c C e,Rh血型鉴定出现假阳

12、性的原因,1）受检细胞已被免疫球蛋白致敏，或标本血清中含有引起红细胞凝集的因子。 2）受检细胞与抗血清孵育的时间过长，含高蛋白的定型试剂会引起缗钱状形成。 3）标本抗凝不当，受检过程中出现凝血或小的纤维蛋白凝块，误判为阳性,4）定型血清中含有事先未被检测的其它特异性抗体，造成假阳性定型结果。 5）多凝集细胞造成定型的假阳性。 6）鉴定器材或抗血清被污染，造成假阳性,Rh血型鉴定出现假阴性的原因,1）受检细胞悬液浓度太高，与抗血清比例失调。 2）漏加或错加定型血清。 3）离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，摇散微弱的凝集。 4）抗血清保存不当，导致失效。 5）定型血清的使用方法错误，没有按说明书进

13、行,弱D型,弱D抗原与大部分盐水抗D试剂不产生直接凝集反应，而与部分的IgG抗D血清用间接抗人球蛋白试验反应阳性。 因此当我们初次得到Rh阴性结果时，必须进行Rh(D)阴性确认试验，即用三种不同批号的IgG抗D定型，如果全部阴性方可认为该被检者为Rh(D)阴性，否则，只要有一批为阳性，则可认为是弱D型,弱D型的临床意义 尽管弱D比正常阳性细胞抗原弱 ，但输给Rh(D)阴 性的受血者后， 自然有免疫产生抗D的可能。同时若接受Rh(D)阳性的细胞后，弱D型人也有可能产生 抗D抗体。因此，作为供血者，弱D型归类为Rh(D) 阳性 ，作为受血者弱D型归类为Rh(D)阴性。 献血者为弱D型，作为RhD阳

14、性血液(AABB标准) 受血者为弱D型，作为RhD阴性受血者(AABB标准,红细胞其他血型系统,Kell血型系统 在该血型系统的二个基因座上共有四个抗原：K与k,和Kpa与Kpb。 K与k抗原都具有一定程度的免疫原性。因中国人几乎100%K抗原阴性，故无抗-K。凝聚胺法无法检测K抗原和抗体。因此，凝聚胺法只适合中国人,二、不规则抗体筛选和鉴定,1）抗体筛选 所谓不规则抗体是指抗A和抗B以外的血型抗体。 筛选细胞 通常是由2-3个单人份的O型红细胞组成一套筛选细胞试剂，包括以下常见的抗原：Rh系统 、MNSs系统、P系统、Lewis系统、Duffy系统等。不能将过多人份红细胞混合，以避免红细胞混

15、合后，对弱抗原红细胞的稀释,抗体筛选试验可在交叉配合试验之前进行或一起进行，这样有利于对患者抗体的早期确认及鉴定临床上具有意义的抗体，避免一些可能的情况而造成病情的延误。大约有0.3%2%的群体血清中含有同种抗体,2）抗体鉴定 自身细胞检查：观察患者（受者）的血清与患者（受者）自身细胞的反应情况，确定血清内是否有自身抗体和同种抗体二者同时存在,使用试剂细胞中的谱细胞（panel cell）应用各种抗体检查技术，检测患者的血清，确定其抗体的特异性。 当患者体内的同种抗体有二种或二种以 上时，可采用吸收放散试验,谱细胞： 一般是由8-16人份的已知血型表现 型 O型红细胞组成，具有各种不同的抗 原

16、成分 ，根据谱红细胞的反应格局一 般可以鉴定常见的抗体,方法： 作抗体鉴定时，必须灵活应用盐水法、抗人球蛋白试验、聚凝胺（Polybrene）法及凝胶法等各种技术，再结合吸收放散等血清学手段，对抗体的特异性作分析,结果的判读和解释,溶血和血液凝集意义相同，都是抗原抗体反应阳性结果。先观察有无溶血，后观察有无凝集。 记录结果，并与以前结果对照,结果的判读和解释,抗体筛选试验不一定能检出所有临床意义的抗体，抗低频率抗原的抗体或有剂量效应的抗体，可能被漏检。这时需要安排抗原性更完全和特异性更强的筛选细胞做试验，或用敏感度更高的技术做检查。 与纯合子抗原红细胞反应较强的抗体被称为具有“剂量效应”，具有

17、剂量效应的血型系统包括Rh（D除外）、Kidd、Duffy、MNSs、Lutheran系统。剂量效应在MN血型系统和Rh血型系统比较明显，在ABO血型等其他系统不明显,三、交叉配血,交叉配血试验也称配合性试验，实际上是检查不配合性，使病人，献血者血液之间没有可测到的不相配合的抗原、抗体成分，试验应在37下进行。在配血的任何步骤中均不产生溶血或凝集献血者的血液才能给予病人输注,交叉配血包括： 1)主侧配血: 受血者血清对供者红细胞，检测对供者红细胞起反应的抗体。 2)次侧配血: 受血者红细胞对供血者血清，检测对受者红细胞起反应的抗体,交叉配血中可能出现的一些特殊问题 （1）缗钱状的形成：血清在室

18、温和37中，使红细胞出现了假凝集，造成配血错误，常见与多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、霍奇金病，以及其它表现为血沉加速的一些病例中。 （2）交叉配血试验结果不相容，显示有未知的同种抗体的存在。 （3）在室温反应中，显示有自身抗体。 （4）血清中如含有溶血性抗体，则相应红细胞被溶解而不是凝聚，结果为阳性若血清中存在补体而溶血，血清应灭火后再做试验,5）存在抗体筛选试验阴性和交叉配血结果阳性的现象，提示可能有未知的抗体存在。 （6）交叉配血试验中，离心力不当，造成假阴性和假阳性。 （7）水浴箱温度不正确，造成错误结果。 （8）红细胞不正确的洗涤和悬浮，使抗球蛋白试验出现假阴性,交叉配血的主要方法,红细

19、胞和血清在盐水溶液中直接反应 特点是操作简便，设备简单，缺点是影响因素多，灵敏度低,盐水凝集法,低离子强度盐水法,通过降低介质溶液的离子强度，减少红细胞外围离子云的强度，促进IgG分子在两个红细胞间桥联，而促进凝集 特点是缩短抗原抗体反应时间，提高反应灵敏度,酶法,利用木瓜酶或菠萝酶破坏红细胞表面唾液酸，使红细胞失去电荷，缩小细胞间距离 同时改变红细胞膜表面结构，使某些隐蔽的抗原暴露，从而增强凝集反应,凝聚胺法,利用多聚季胺盐在介质溶液中产生大量正电荷中和红细胞表面的负电荷，减少红细胞间排斥，促进凝集,抗人球蛋白法,在盐水凝集法的基础上，加入抗人球蛋白抗体，通过抗人球蛋白抗体的特异性桥连作用，

20、促进红细胞的凝集,凝胶卡式配血法,将红细胞和血清加在凝胶上部反应，离心后观察凝集的红细胞，被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央，判断凝集反应阳性游离的红细胞，被挤过装有过滤介质的小柱，而到达小柱的底部，判断凝集反应阴性,抗体筛选和交叉配血结果分析,抗体筛选阴性，交叉配血相合 见于临床上绝大多数标本。 抗体筛选阴性，血清中仍有可能含有临床有意义的抗体（方法或筛选细胞） 盐水介质试验作配血可能漏检有意义的IgG类抗体。 只有用非盐水介质交叉配血，才能保证待输的血和受者相合,抗体筛选阴性，盐水直接离心交叉配血不合 ABO血型错误。 抗A1存在于A2或A2B，在直接盐水交叉配血实验中，抗A1能引起大部分A型

21、红细胞不相合,抗体筛选阴性，抗人球蛋白交叉配血不合 献血者红细胞DAT阳性（约1/10000） 患者抗体弱，献血者红细胞抗原性很强，表现为抗人球蛋白试验阳性。 针对低频抗原的抗体，如Diego系统抗-Wra,抗体筛选阳性，交叉配血不合 同种抗体、自身抗体、试剂问题、缗钱状凝集，应在输血前查明原因。 必须进行包括抗人球蛋白试验在内的交叉配血，配合后方能输注。 若无法找到血清学配合的血液，输血科工作人员必须及时告知主管医生输血存在的危险。若患者病危且临床坚持要输，必须家属签署知情同意书，并经主管医生签名纳入病历后方可发血。并建议输注去白加洗涤红细胞,血型、抗筛、交叉配血是输血前试验的“三保险” 相

22、合% 随机 64 ABO 99.4 Rh 99.8 抗筛 99.94 交叉配血 99.95 自身输血 100,ABO亚型漏检 不规则抗体漏检 尤其是低效价,低亲合力不规则抗体 漏检 交叉配血漏检 一般抗筛与配血方法相同, 抗筛漏检, 配血自然也会漏检,病例探讨,患者 女 ,46岁,2012年3月7日因乙肝肝硬化，消化道出血入院，查Hb 46g/L ,血型A型，Rh 表型 ccDEE ，当日申请输注A型悬浮红细胞4U，输完第一袋1.5U，第二袋输注约50ml后，出现血尿、高热，停止输血。输血后立即复查Hb 62g/L ，10余小时后再复查Hb 53g/L 。 分析： 输血史：2月23日于当地医院

23、输过红细胞，3月3日出现不明原因血尿 复查供受者血型 ：A 型，RH(D)阳性 新旧标本重做交叉配血、抗体筛选：聚凝胺法，抗人球法均阴性 输血后患者标本做Coombs试验 ：DAT阴性，标本外观溶血,四、抗人球蛋白试验,抗人球蛋白试验是1945年由Coombs等人建立的，又称Coombs试验。分为直接抗球蛋白试验（DAT）和间接抗球蛋白试验（IAT,抗人球蛋白试验原理,IgG类血型抗体（主要是免疫抗体，如Rh血型抗体）分子量小，与红细胞相应抗原结合后，在盐水介质中不出现肉眼可见的凝集反应，称之为不完全抗体，但在加入抗-IgG后，以其搭桥作用则可出现凝集反应。 补体成分在体内被红细胞抗原抗体复合

24、物激活以后，结合在红细胞表面。在体外含补体的多克隆抗体，或抗C3b、抗C3d等单特异性抗体与补体致敏的红细胞反应，使之凝集也称为抗人球蛋白试验,抗人球蛋白试剂,多特异性抗球蛋白试剂：应含有抗IgG和抗-C3d。 单特异性抗球蛋白试剂：抗IgG、抗IgM、抗IgA、抗C3、C4的片段,直接抗人球蛋白试验,DAT是用来检测体内红细胞致敏情 况，尤其是IgG和C3d包被的红细胞。 用于： HDN和自身免疫溶血性贫血的诊断 红细胞被药物抗体致敏的检查 急性和迟发性溶血性输血反应的检查,间接抗人球蛋白试验,用于测定血清中存在的不完全抗体。 用已知的不完全抗体来测定红细胞血型，如Rh血型。 交叉配血,结果

25、分析-假阳性,1)用免疫兔或羊制备的抗人球蛋白含有种间抗体。 2)红细胞在用盐水洗涤时已有凝集。 3)IAT试验中所用O型红细胞本身DAT阳性,4)不抗凝标本在冷环境里经过一段时间的保存后，自身冷抗体发生作用，激活补体，补体成分结合在红细胞上，用多特异性抗球蛋白试剂会发生假阳性。 5)离心过度，红细胞压积过紧，不易充分摇散,结果分析-假阴性,1)致敏后的红细胞洗涤不充分,残留的球蛋白中和了试剂中的抗球蛋白，造成假阴性。 2)操作过程不连续，时间过长，结合在红细胞上的抗体解离。 3)红细胞、血清和抗人球蛋白试剂保存不当都可能发生活性减弱或丧失,4)红细胞过多，反应减弱；红细胞过少，看结果不准确，

26、都影响结果。 5)试剂中抗人球蛋白浓度过大，有前带现象。 6)孵育时间和温度不当，会使反应结果减弱或变为假阴性。观察结果时过度摇动试管，摇散细小凝块,注意事项,每次试验要设有阴性和阳性对照。 阴性结果要加入一滴IgG致敏红细胞 实验器材清洁。 注意抗原抗体比例、孵育时间、温度等条件。 严格按照实验方法操作。 排除自身抗体干扰,DAT阳性患者引起的疑难配血,主要有以下两种: 交叉配血主侧阳性,次侧阳性 这种情况下患者血清往往含有自身抗体且伴有不规则抗体的存在。 （1）用自身红细胞进行吸收试验，去除患者血清中的自身抗体。 （2）取吸收去除自身抗体患者血清做不规则抗体筛查和特异性鉴定，选与不规则抗体

27、相对应抗原阴性的红细胞做交叉配血试验的主侧试验。 （3）患者红细胞做放散试验用放散掉自身抗体的红细胞做交叉配血的次侧试验,交叉配血主侧阴性,次侧阳性 这种情况下患者往往是红细胞被自身抗体吸附或致敏而血清中无同种不规则抗体的存在，可先用患者红细胞做放散试验，用放散掉自身抗体的红细胞做交叉配血的次侧试验,所有输血前患者作常规DAT检测。 DAT阳性一般建议输注主侧配合的洗涤红细胞，并且尽量避免血浆、血小板等血液成分的输注,五.血小板输注前的抗体检测及 配合试验,随着成分输血的广泛开展和应用，以及血液成分保存技术的提高，单采血小板的输注量逐年上升。随之而来的因血小板输注而引起的输注无效已成为临床上极

28、为突出的问题。因此，做好血小板输注前的抗体检测及配合试验将是目前行之有效的办法,血小板血型系统,血小板血型：1959年，Van Loghem发现 血小板血型抗原主要有二大类 ： 血小板非特异性抗原（血小板相关抗原） 血小板特异性抗原 （HPA,血小板非特异性抗原,血小板表面存在的与其他细胞或组织共有的抗原称血小板非特异性抗原。 包括主要组织相容性抗原（HLA）和红细胞血型系统相关抗原,血小板表面的HLA抗原系统,血小板表面存在HLA-A、HLA-B和HLA-C位点等HLA类抗原。 未发现血小板表面存在HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ等类抗原。 但是经过细胞因子的刺激，在血小板表面能产生

29、HLA-DR抗原,血小板表面的红细胞血型系统,血小板表面存在ABO、Lewis、I、i和P等红细胞血型系统抗原。 但不存在Rh、Duffy、Kell、Kidd和Lutheran等血型系统抗原,血小板特异性抗原,血小板输注无效（PTR,约有2050%白血病患者，80%再障患者在 长期输注血小板后，发生血小板输注无效,血小板输注无效的原因,免疫性：包括HLA抗体、血小板特异性自身抗体、同种抗体、ABO抗体、免疫性复合物等。 非免疫性：脾肿大、脾切除、骨髓移植、DIC、静注两性霉素B、抗菌素、出血、发热等。同时与输注的血小板寿命也有关,同种免疫因素与血小板输注无效,对于血小板输注无效，一般涉及: ABO抗原 HLA-A、B抗原 HPA抗原,ABO血型系统抗体在PTR中的作用经常被忽视，事实上，抗A、抗B可以缩短血小板寿命，有时也是引起PTR的原因。（骨髓移植后血小板输注问题） HPA抗体多与HLA抗体