生物化学--核酸化学.ppt

1、2.5 核酸的理化性质及其应用,2.5.1 核酸的一般性质 2.5.2 核酸的紫外吸收特性 2.5.3 核酸的变性、复性 2.5.4 分子杂交,2.5.1 核酸的一般性质 RNA为白色粉末，DNA是白色纤维状固体，二者均微溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用70%乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。 核酸既有碱性基团，又有磷酸基团，故为两性电解质，但酸性强。介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动。 大多数DNA为线性分子，长度可达数厘米，直径仅为2nm，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。,天然DNA,核苷酸总吸收值,变性DNA,2.5.2 核酸的紫外吸收特性（max=2

2、60nm）,纯DNA OD260/OD280=1.8 纯RNA OD260/OD280=2.0,2.5.3 核酸的变性、复性,是双链核酸分子的二个重要物理特性； 双链DNA、RNA双链区、DNA: RNA杂交双链都有此性质。,2.5.3.1 核酸的变性（denaturation）,(1)变性的概念：双螺旋结构打开，形成无规则线性结构的过程。,(2)结构和性质的变化： 化学键变化：氢键、疏水键断裂，不涉及共价键的断裂。 结构变化：改变核酸空间结构，一级结构不变。 增色效应：DNA变性后，溶液紫外吸收作用增强的效应。 原因：在双螺旋结构中，有序堆积的碱基紫外吸收降低，当DNA变性后，双链解开，碱基

3、外露， 260nm紫外吸收增大，产生增色效应。,(3)变性的因素： 加热 极端的pH 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素等）。,DNA的热变性,特点： 狭窄性：变性温度范围小。 爆发式：像晶体的熔点，到达变性温度后，DNA很快变性解链，故名熔解温度。,DNA热变性曲线,熔解温度（melting temperature，Tm）：DNA 分子双链解开50%所需温度。一般DNA的Tm值在80-90C之间。,Tm值的影响因素：,碱基组成： （G+C）含量越高，双螺旋结构的越稳定，Tm值越大，氢键数GC，A=T 。 计算Tm的经验公式(在0.2mol/L NaCl溶液中) : X%（G+C）=2.44（Tm-6

4、9.3） 另外，当DNA链碱基数20： Tm=4（G+C）+2（A+T）,Tm值的影响因素：,DNA的均一性： DNA分子中碱基组成的均一性：如只含有一种碱基对的多核苷酸片段，Tm值范围很窄，变性时氢链断裂几乎可“齐同”进行 待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其 Tm 值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则 Tm值范围较宽,复性：在一定条件下，变性DNA单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，DNA的功能恢复。 减色效应：变性DNA复性过程中，伴有A260减小的现象。,2.5.3.2核酸的复性（renaturation),影响复性的因素,温度和时间 DNA浓度 DNA序列的复

5、杂度,温度和时间,一般认为比 Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，一般为60 左右。 复性时温度下降必须缓慢，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温，复性几乎不可能。核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性（单链）状态。,DNA浓度,DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。 “成核”速度与DNA浓度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。,DNA顺序的复杂性,简单顺序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）这二种单链序列复性时，互补碱基的配对容易。 顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分（一般以单拷贝存在于基因组中），这种复杂的特定序列要实现互补，显然要

6、比上述简单序列困难得多。,定义：不同来源的DNA单链间、单链DNA与RNA、RNA与RNA之间存在碱基配对区域，复性时形成杂交分子的现象。,2.5.4分子杂交(简称杂交，hybridization),常用的杂交方法有: Southern（DNA)印迹法:利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 Northern （RNA)印迹法: 将RNA固定在硝酸纤维素膜上后,用互补的,具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交.,2.5.4分子杂交(简称杂交，hybridization),本章重点,五种碱基及相应的核苷酸及脱氧核苷酸的结构式；碱基与戊糖的连接方式；核苷酸残基的连接方式； DNA双螺旋结构的基本要点 tRNA的结构特点 一级结构：由7090个核苷酸组成单链；含较多的稀有碱基；5端多为PG 、3端多为CCAOH 。 二级结构：三叶草形、四臂