人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备

1、人类染色体标本的制作,细胞与遗传学教研室,一、实验目的,1.,掌握人类染色体标本的制作方法,2.,了解人类染色体形态结构特征,24hrs,时加,入,BrdU,68 hrs,时加,入秋水仙素,人类外周血,植物血球凝集素,( PHA,）,肝素、培养基、小牛血清,体外培养,72 hrs,后,收集细胞,制作玻片标本,固定,预固定,紫外线照射,低渗处理,Giesma,染色,R,带,Giesma,染色,C,带,Giesma,染色,G,带,Ba(OH),2,处理,荧光染料染色,Q,带,染色体带的制作方法,二、实验原理,?,外周血,中的淋巴细胞几乎都是处在,G,0,期或,G,1,期,，,一般情况下是,不分裂,

2、的。,?,当在培养基中加入,植物凝集素（,PHA,）,时，小淋,巴细胞受到刺激后,转化为淋巴母细胞,，并,开始,进行,有丝分裂,。,?,经过,短期培养,后，用,秋水仙素,处理、,低渗,、,固,定、滴片和染色，,就可获得大量,中期分裂相,的,细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察,.,?,这种培养方法是,Moorhead,于,1960,年建立的。,外周血,淋巴细胞,PHA,37,68h,G0,期或,G1,期,秋水仙素,至,72,h,三、实验用品,?,1.,材料：人体外周血,?,2.,器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸,管、恒温水浴锅等,?,3.,试剂：培养基、秋水仙素（12.5gml）

3、、,植物凝,集素（,PHA,）,、肝素、,0.075Mkcl,低渗液、甲醇、冰乙,酸、,PH6.8,磷酸缓冲液、,Giemsa,原液。,四、实验方法,1.,外周血细胞培养,（,1,）采血：无菌，肝素抗凝。,用无菌注射器抽取肝素,0.2ml,润湿针筒,推出多,余肝素,.,消毒后,抽取受试者静脉血,2ml,。,）,（,2,）接种培养：每培养瓶加入,0.3,0.5ml,（,10,滴）,接种于装有,5ml,培养基的培养瓶中，摇匀，,37,培,养箱中培养,68,小时,。,（,20,滴）,?,?,（,3,）秋水仙素处理：,0.05,0.4,g,ml,培养基，轻,摇混匀后，继续培养至,72,小时,。,实验方

4、法,2.,染色体的制备,（,1,）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以,1500,转,/,分离心,10,分钟，弃去上清液，留下沉淀物约,0.3ml,。,（,2,）低渗处理：加入预温,37,的低渗液至,8ml,，用吸管,轻,吹打,混匀，置于,37,恒温水浴锅中低渗,20,分钟,。,低渗后吹打要,轻,以防细胞破裂,.,（,3,）预固定：缓缓加入,1ml,新配制的固定液（甲醇：冰乙酸,=3:,1,），立即用吸管轻吹打混匀。以,1500,转,/,分离心,10,分钟,，弃,上清液，,留约,0.3ml,沉淀物。,（,4,）固定：加入新鲜固定液至,8ml,，吸管吹打混匀，室温固定,20,分钟,，,1

5、500,转,/,分离心,10min,，去上清液。依上述方法再,重复固定,1,次。,实验方法,（,5,）制备细胞悬液：,预留,0.2,0.3ml,固定液,，,加,2,滴新配固定液制成细胞悬,液,（,6,）滴片：,吸取细胞悬液，滴,2,3,滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火,焰上过火后，空气干燥。,(,每组,3,张，只染,1,张）,（,7,）染色：,Giemsa,染液染色,10,分钟，自来水轻冲洗，晾干，镜检。,五、实验结果,?,在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分,裂相，再转至油镜观察。,六、实验注意事项,1.,接种的血样愈新鲜愈好,。,2.,培养中成败的关键,除了至为重要的,PHA,的效,价外。培养的温度和培养液的酸碱度也十分,重要。,3.,培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶,轻轻振荡，使凝块散开，继续放回3