植物显微技术

1、生物显微镜,单式显微镜,放大镜,普通光学显微镜,研究显微镜（与数码技术结合）,红外显微镜,荧光显微镜,离心显微镜,显,微,镜,的,种,类,电子显微镜,复式显微镜,偏光显微镜,相差显微镜,干涉差显微镜,倒置显微镜,暗视场显微镜,体视显微镜（解剖镜）,常用植物制片技术,植物制片的分类,临时制片,按保存时间分,永久制片,活体观察,按制作方法分,切片法,非切片法,徒手切片法,切片法,石蜡切片法,冰冻切片法,植物显微化学（组织化学）制片,涂片法,非切片法,压片法,离析法,整体装片法,一、徒手切片法,1,、准备,显微镜、镊子、解剖针、刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、绸布,或纱布、染料,2.,切片,23 cm

2、,的材料一段，用左手大拇指或食指夹住材料，上方突出于手,指,23 mm,，不宜太高，否则材料容易摇动。右手以拇指和食指拿稳刀片,即可切片。切片时为了避免材料干枯，应使材料的切面和刀刃上保持,有水，呈湿润状态。每切,23,片后，移入盛有清水的培养皿中。,如果切面倾斜，应立即纠正。,过于柔软的器官，例如幼嫩的叶片，需用胡萝卜根或马铃薯块茎,等作为支持物，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。,选择比较完整的切片进行染色和封片。,一、徒手切片法,3.,染色,染色的方法很多，视材料的要求不同，选用不同的染料。,4.,封片,注意尽量防止产生气泡，封片完毕后，用纱布擦去多余水，,即可在显微镜下观察。,二、石

3、蜡切片法,石蜡切片技术是显微技术上最重要最常用的一种方法，优点在于（,1,）,应用范围广，几乎适用于所有的植物材料；（,2,）能切成极薄而且连续的切,片，较清楚地显现细胞、组织的细微结构；（,3,）切片可以长期保存，便于,以后观察比较。因此，这项技术自,18,世纪创建以来，在植物细胞、组织研究,史上发挥了重要作用，并且在今后仍将作为一项常规技术而发挥作用。,石蜡切片技术的整个过程较复杂，可大体概括为：,取材,切片,固定,粘片,脱水,脱蜡复水,透明,染色,浸蜡,包埋,修块,封片,脱水透明,1,、取,材,根据观察目的不同，选用合适的新鲜材料，要求“精而小,”,不在于“大而多”，应注意：,取材的代表

4、性。,材料新鲜，大小在,0.5,1,厘米，有利于固定液的透入。,刀片锐利，立即固定，如不能即刻固定，须尽量防止变,干、损伤。,详细记录日期、采集地点、标本名称、取材部位、固定液,种类。,2,、固,定,用一定的化学溶液（固定剂）在尽可能保持细胞生活结,构的情况下迅速杀死组织的过程。,作用：,防止组织溶解及腐败；,使细胞内各种成分沉淀保存下来，保持它原有的生,活结构；,使细胞内的成分产生不同的折射率，造成光学上的,差异，便于观察；,使细胞硬化不容易变形，利于固定以后的处理。,常用固定液：,酒精,甲醛,醋酸（简称,F.A.A,）,固定液,适用范围：,是生物制片中最常用的一种良好固定液和保存液。一般植

5、物的器官,和组织均可用此液来固定，称为“标准固定液”或“万能固定液”。,配法,:,50%,或,70%,酒精,冰醋酸,甲醛,90,毫升,5,毫升,5,毫升,材料在此固定液中，固定,24,小时即可进行脱水步骤。同时它又是良好,的保存液（,4,）,，材料在此液中放置很久也无妨碍，甚至保存数年仍可,制作切片。,卡诺氏固定液,适用范围：,根尖、花药、子房,配法,1,：,95%,乙醇,3,份,+,冰醋酸,1,份,配法,2,：,95%,乙醇,6,份,+,冰醋酸,1,份,+,氯仿,3,份,（固定花药，观察减数分裂）,固定,24h,，转入,70%,乙醇中，于,4,冰箱保存备用。,（若在短时间内压片观察，可保存在

6、固定液中）,、脱,水,材料从固定液中取出，需先冲洗。,F.A.A,固定液，用,50%,或,70%,酒精冲洗。,卡诺氏固定液，用,95,85,70,酒精冲洗。,脱水的步骤：（,若采用整体染色法，先染色,2-3,天，再脱水,）,梯度酒精：,50%,、,70%,、,85%,、,95%,、,100%,。事先配好，随时取用。,从低到高，逐级脱水。,100%,酒精需,2,次。,各级酒精停留的时间，依材料的性质、大小、而定。根尖、茎尖、每,级,30,分钟,1,小时，草本植物组织为,2,小时，木本根、茎,2,4,小时，大的或较,坚硬的材料，各级停留的时间还要延长些。在操作时，低浓度酒精可稍,快些，到高浓度酒精

7、时则不能过快，这样才能脱净水分。,从,95%,进入纯酒精后，时间不能过长，否则材料变得硬脆。为了彻底将,水分脱净，需要更换两次纯酒精，每次,30,分钟,1,小时。此时，瓶子上的塞,子也应更换干燥的，以免有水分渗入。,4,、透,明,二甲苯是应用较广的一种透明剂，透明力强，但缺点是材料在其,中停留过久，容易发生收缩、变脆、变硬，常用氯仿（三氯甲烷）代,替二甲苯。,将氯仿配制成下列不同的浓度,2/3,乙醇,+1/3,氯仿、,1/2,乙醇,+1/2,氯仿、,1/3,乙醇,+2/3,氯仿、纯氯仿，事先配好，随时取用。,为了避免组织收缩，材料经无水乙醇脱水后，不能直接移入纯氯,仿中，而必须经过以上几个级度

8、逐渐置换，才能进入纯氯仿中。,材料在每级中停留时间，视组织块的大小而定，一般,30,分钟,2,小时，在纯氯仿中应更换,2,次，再用纯二甲苯更换,2,次（,20,分钟,1,次）。,5,、浸,蜡,（,1,）将石蜡配成下列浓度：,2/3,二甲苯,+1/3,石蜡、,1/2,二甲苯,+1/2,石蜡、,1/3,二甲苯,+2/3,石蜡、纯石蜡，事先配好，随时取用。,（,2,）材料放入,2/3,二甲苯,+1/3,石蜡中，将其放入,36,40的温箱中，时间,2,小时。,（,3,）材料放入,1/2,二甲苯,+1/2,石蜡中，温度控制在,45,55，时间,2,小时。,（,4,）材料放入,1/3,二甲苯,+2/3,石

9、蜡中，温度控制在,50,60，时间,2,小时。,（,5,）材料放入纯石蜡,1,、纯石蜡,2,中，温度控制在,50,60，时间各,2,小时。,浸蜡应在恒温箱中进行,恒温箱的温度要适宜，太高，会使材料收缩，太低,，石蜡会冻结而不能透入组织。,6,、包,埋,把透足石蜡的材料包埋在石蜡里成为一定的形状以便切片。,在,60,的温箱中，换两次已溶解的纯蜡，每次约,2h,。包埋之前，先准,备好包埋用具，一般需要镊子、酒精灯、火柴、一盆冷水及包埋用,的纸盒，包埋时将融化的石蜡倒入纸盒中，迅速用烧热的镊子把材,料放入并按需要的切面和一定的间隔排列整齐，然后平放入冷水中,，使其快速凝固。包埋好的材料（石蜡块），可

10、长期存放在,4,冰箱,中，备切片用。,7,、修块与固着,将包埋好的材料切割成小块，每个小块包含一个材料。然后按,需要的切面将蜡块切成梯形，切面在梯形的上部（注意上部矩形的,对边平行）。用烧热的蜡铲将梯形的底部固定在木块上。,8,、切,片,把包埋好的材料块用轮转式切片机切成连续的蜡带。,切片时，将材料夹在切片机的固定位置上，调整材料切面,与切片刀口平行，根据观察的要求调节好所需要的厚度（,5-,12m,），转动切片机进行切片。切片过程中往往会出现各种,问题，需要分析原因，及时纠正。,（刀口锋利、刀片角度,5,一,8,、切片厚度,5-12m,）,9,、粘片、展片、烤片,在预先洗净并干燥的载玻片上涂

11、上一小滴粘贴剂（用量绝不可多），,用洗净的手指反复涂匀，然后加,12,滴,3,福尔马林或蒸馏水，用镊子轻轻,将蜡片放在液面上，将此载玻片放在,45,左右的,温台,上，至蜡片受热慢慢,伸直展平为止，用解剖针调整蜡片在载玻片上的位置，吸去多余水分，置,入,30,温箱中烘干，时间约需,24h,。,粘贴剂的配法：,明胶,12 g,石碳酸（苯酚）,2g,蒸馏水,100ml,甘油,15ml,。,先将蒸馏水加温至,3040,，慢慢加入明胶，待全部溶解后，再加入,2g,苯,酚和,15ml,甘油，搅拌至全溶为止，然后用纱布过滤，滤液贮于瓶中备用。,10,、染色封片,常用的染料有：,番,红：,植物组织学常用染料，

12、碱性，常用于与固绿、亮绿,对染，染色效果：木化细胞壁红色，角化细胞壁粉红色，,栓化细胞壁黄褐色，染色体、核仁、中心体红色。,固,绿：,酸性染料，可将细胞质和纤维素壁染成绿色。,苏木精：,用于幼嫩组织的染色（花药、子房、根尖），细,胞核染成蓝色。,10,、染色封片,染色方法视材料不同而选择。下面以植物制片中最常,用的,番红与固绿对染,的方法为例，说明从脱蜡、染色至最,后封藏的全部制片程序（均在染缸中进行）。（,若采用整,体染色法，直接脱蜡、透明、封片）,（,1,）脱蜡：取已干燥好的载玻片放入二甲苯中脱蜡，约,10min,。,（,2,）过渡：转到,1/2,二甲苯和,1/2,纯酒精的混合液中过渡约,

13、5min,。,（,3,）复水：脱去蜡的切片依次浸入,100,95,85,70,50,30,酒精中各,12min,，最后浸入蒸馏水。,（,4,）番红染色：置,0.5,1,番红水液中,染色,224h,。,（,5,）冲洗：用自来水洗去多余的染液。,（,6,）脱水：依次用,30,、,50,和,70,的酒精处理约,30min,。,（,7,）固绿复染：用,0.1,固绿的,95,酒精溶液,复染,1040s,。,（,8,）继续脱水：用,95,酒精和,100,纯酒精两次彻底脱水，每次,3060s,。,（,9,）透明：用纯酒精和二甲苯各半的混合液处理,5min,，再用纯,二甲苯浸,5min,，使材料完全透明。,（

14、,10,）封片：加一滴加拿大树胶或优帕胶在材料上，盖上盖玻,片，然后在,3035,恒温箱中烘干。,三、冰冻切片法,冰冻切片具有快速、简便、易操作等特点，且有利于,进行如免疫定位和原位杂交的研究。冰冻切片技术在动物,和人体的研究中已广泛应用。但由于植物细胞结构的特殊,性，在植物的研究中难以推广。与动物细胞相比，植物细,胞有细胞壁和大液泡，含水量远大于相同体积的动物细胞,，因此，较动物样品更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，,进而损伤植物细胞的细微结构。此外，冷冻后的植物样品,比动物样品硬度大，难以切片和保持植物组织结构的完整,性。,四、涂片法,适用于花粉和花粉母细胞等疏松组织。,1.,取材,如需要观

15、察花粉母细胞减数分裂全过程，就必须采集幼,嫩的呈绿色的花药较为适宜（浅绿色而透明者太嫩，黄绿色,或黄色者则已过时）。一般于清晨,67,时和下午,45,时取材，植,物种类不同，有差异。,2.,固定,卡诺氏固定液，,24h,后，经,95,和,85,酒精浸洗，再转入,70,酒精中保存在,4,的冰箱中。,3.,染色与涂布,取固定好的材料转入,50,酒精，经蒸馏水清洗后，取出一,个花药置清洁的载玻片上，加一小滴,改良苯酚品红,染色液，,用刀片切去花药的一端，用小镊子夹着花药，将其切面放在,载玻片上涂抹；或用刀片在花药中部横断为二，再用解剖针,从花药的两端向中部断开处压挤，使花粉母细胞散出，并涂,布成一薄

16、层（注意去掉药壁的残渣），再滴一滴,45,醋酸使之,软化与分色；盖上盖玻片，用橡皮头轻压盖玻片，使花粉母,细胞均匀散开即可观察。,五、压片法,细胞学研究中常用的方法，如根尖、茎尖和幼叶等。,步骤：取材预处理固定解离染色压片镜检,1.,取材,：根尖或茎尖，长度为,23,m,。,2.,预处理,：使细胞分裂停留在有丝分裂的中期，并使染色体缩,短变粗。,8-,羟基喹琳、对二氯苯、秋水仙碱、低温（冰水混合物）,预处理的时间,24h,左右，但不同植物有差异,3.,固定,：卡诺氏固定液，,24h,后，经,95,和,85,酒精清洗，再转,入,70,酒精中保存在,4,的冰箱中。,4.,解离,：,材料在,50,酒

17、精浸泡,5min,，再入蒸馏水洗涤,5min,后，,转入,lmol/L,的盐酸溶液中，,60,恒温水浴,510min,（材料不同有差,异），时间太短，细胞不易分离，时间过长，则染色体染色,浅或不着色。,5.,染色,：,改良苯酚品红、席夫试剂（孚尔根染色）,6.,压片,：只保留分生区，除去根尖的其余部分，使细胞分散,并压平。,7.,镜检,六、离析法,在观察植物器官内不同组织的细胞特征时，切片方法往往不能得到,单个细胞的立体形态，因此常采用离析的方法获得分散的细胞。离析法,的原理是用一些化学药品配制离析液把细胞壁中的中层物质（果胶质）,溶解，使细胞分离散开，便于观察。,铬酸,-,硝酸离析液：,铬酸、硝酸等量混合,离析木质化组织，如导管、管胞、纤维,盐酸,-,酒精离析液：,浓盐酸、,95%,酒精等量混合,离析薄壁细胞,七、整体装片法,适用于微小或扁平的材料，例如丝状或叶状的藻类、菌,类、蕨类的原叶体、孢子囊