实用生物医学实验技术：Western blot 技术原理、常见问题及解决方案

1、,Western blot 技术原理、常见问题及解决方案,Western Blot简介及原理 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题及解决方案,主要内容,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。,而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分

2、析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）,Western Blot 基本原理,Western Blot 优点,高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 流程,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,细胞总蛋白的提取,提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理

3、。提取蛋白质的方法很多， 鉴于后续实验对蛋白性质的要求不同，因此很难找到一种万能的裂解方法。,不论采用那种方法，都应遵循以下原则： 1尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 2细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。本实验中选用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为蛋白酶抑制剂。 3样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80。切勿反复冻融已制备好的样品。,BRIPA buffer： Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 NP-40 1% 去氧胆酸钠 0.25% NaCl 150 mM EDTA

4、1 mM,目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续实验的需求,A细胞总蛋白裂解缓冲液(100 ml)： 1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1PBS缓冲液至100ml.,注意事项,1.注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。,2.所用离心机需提前预冷。,3.为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。,4.吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。,蛋白定量,Western Blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组 之间总蛋白量基本一致;,

5、蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力,基于以上两方面原因，在进行蛋白电泳之前，先要对提取的总蛋白进行含量测定,目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶

6、液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。,在选择方法时应考虑： 实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。,本实验中用的Bradford法基于以下原理： 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比,此法的不足之处： 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同

7、，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。,Bradford法由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用 ： 1.灵敏度高：可精确定量 11000 g/ml 的蛋白样品。 2.测定快速、简便：只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。 1 小时内吸光度变化不超过10%。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 3.干扰物质少：如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。,注意事项,1制作的BSA

8、标准曲线如不规律，应重新再做。 2如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释1020倍后再测定；如样品浓度低，可适当减少稀释倍数。使测得的OD值落在标准曲线范围之内。,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量3060g。,SDS(十二烷基硫酸钠 )：,阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除

9、了不同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！ SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 神经毒素！ 过硫酸铵(AP） 神经毒素！ Tris-甘氨酸电泳缓冲液,注意事项,1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩 2.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制 3.溶液中一旦加入TEM

10、ED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中 4.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的1蛋白质电泳上样缓冲液 5.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳,凝胶浓度与蛋白分离范围,灌制分离胶 隔绝空气,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制浓缩胶 插入梳子,样品,加样槽,蛋白质分子的迁移方向,电泳,采用恒压的方法：1.恒压80V，至样本跑过 浓缩胶；2.将电压调至120V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行转膜。,1 2 3 M,电泳之后凝胶染色扫胶,注意： 做western blot通常用预染maker！,转膜,转膜现有两种方法： A. 半干转：采用恒流的方法，按照

11、1mA/ cm2计算总电流量，时间约为25-60min。（本法多使用NC膜） B. 湿转法：采用恒流的方法，横压100V，1-2小时本法多使用PVDF膜，本法会产生大量的热量，且对温度敏感度较高，需用大量冰块降温）,转一张膜需准备6张滤纸和1张转印膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。转膜前，转印膜以及滤纸均需浸润在电转液中活化15-20min（其中PVDF膜需在无水甲醇中活化5-10min后再浸润于电转液中，且滤纸应与胶和膜的大小一致）。 将玻板轻轻撬开，将凝胶剪裁后从玻板上移至电转液中。从阴极到正极，按照三层滤纸 凝胶 转印膜 三层滤纸的顺序制成“三明治”（如为湿转，应在三

12、明治的两侧各加一层活化过的海绵，同时应注意去除膜、凝胶和滤纸之间的气泡，且两侧的滤纸不能相搭，避免短路引起转膜不全）。,将制好的三明治放入电转槽中，注意正负极的方向，凝胶侧为负极，转印膜侧为正极。 转完后将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。 将凝胶用考马斯亮蓝染色，观察凝胶中的蛋白是否完全转至印迹膜上。,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维

13、素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。,膜,湿转系统,注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极 2.保证每层之间没有气泡 3.转膜过程产生大量热量，需冰浴,夹板 海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵,正极,负极,半干转印系统,注意： 防止短路！,转膜后检测,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,封闭,作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂： 5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶

14、于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）,室温孵育1h或4过夜,注：Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。 3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。 5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 6.加入显色底物进行显色反应。,不同标记的二抗及成像方法,125I标

15、记的抗体 X-光片压片显色 荧光基团标记的抗体 凝胶成像仪,不同标记的二抗及成像方法,酶标抗体 ：如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等 成像方法：加酶的底物产生显色反应或化学发光反应,显色反应：TMB，CN，DAB等显色底物 优点：方便、便宜，直接成像 缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测,化学发光显色： 标HRP二抗加ECL底物发光反应压片或CCD成像 优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、 特异性高、可重新剥离检测,灵敏度：二者接近！CCD胶片曝光,压片 vs. CCD成像,压片实例,压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶

16、片位置在胶片上标出Marker的大概位置,CCD成像 动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析,Marker直接叠加在化学发光图像上 Western Blot化学发光成像,其他成像方法示例,Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 分析软件如Image J等,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶玻璃板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 条带微弱？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意