蛋白纯化思路

1、上清纯化 挂柱 不挂柱 纯 不纯 标签不正常 标签正常 无标签 量够 量不够 再次挂柱 换纯化方式 换纯化方式 换纯化方式 换纯化方式 透析 透析 再次纯化 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 正常 不正常 量够 换纯化方式 再换纯化方式 再换 再换 再换 纯化 纯化 纯化 纯 不纯 方法 方法 方法 终止 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 终止 终止 终止 包涵体纯化溶解（8M尿素） 不溶解（8M尿素） 挂柱 不挂柱 溶解（6M盐酸胍） 不溶解（6M盐酸胍） 纯 不纯 标签不正常 标签正常 无标签 不溶解（SDS） 溶解（SDS） 量够 量不够 再次挂柱 换纯化方式 换纯化方式 换

2、纯化方式 换纯化方式 复性 复性 再次纯化 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 终止正常 不正常 量够 换纯化方式 再换纯化方式 再换 再换 再换 纯化 纯化 纯化透析 透析 纯 不纯 方法 方法 方法正常 不正常 终止 纯 不纯 纯 不纯 纯 不纯 终止 终止 终止 上清纯化(1) 上清纯化：挂柱和不挂柱。(2) 当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度和量达标时，可进行透析试验。透析试验正常（浓度达标），可进行分装；透析试验不正常（浓度不达标），要么浓缩（离心或甘油），要么重新取样将蛋白浓度控制高一点；透析试验不正常（出现沉淀），要检查透析时的浓度，透析Buffer，PH值是否正常，

3、不正确要改正，并结合参考文献和客户的要求，以确定最终的透析条件。(3) 当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度达标时，但是量不够时，可重新接大瓶后再次纯化以达到所需的量。与此同时可将先纯化得到的不足量的蛋白去做透析小试，以便为此后的足量蛋白透析摸索条件。(4) 当蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度不达标时，先判断是否是洗脱时洗脱Buffer的梯度选择有问题，或者是梯度没有洗脱彻底。如果是上述原因，可将样品再次挂柱，选择最佳洗脱梯度并洗脱彻底。或者将不纯的样品挂离子柱，若纯度达标则进行下一步操作，若纯度还不行，可将不纯的样品过分子筛，若多种纯化方式结合后纯度依然不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。(5)

4、 当蛋白不挂柱时，目标蛋白带标签的要考虑一下标签是否正常。通过Western blot等方法检测标签是否正常，如果标签正常，有可能是蛋白的标签没有暴露，可以加入足量的还原剂等使其标签暴露，也可以通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；如果标签不正常，有可能是在样品处理时将其所带的标签断裂，其与不带标签的蛋白处理方法一样，通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；以上的方法纯化的蛋白纯度达标可进行下一步，若已经通过组合纯化的方式纯度不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。(6) 在纯化上清时，会经常出现蛋白不稳定（降解或沉淀）的情况，所以在处理样品时就可以另外加入12mM DTT，或者在收集时在洗脱Buffer

5、中加入12mM DTT。并且纯化时的速度要快，且全程必须在冰浴中进行。 包涵体纯化（1） 包涵体纯化：溶解（8M尿素） 和 不溶解（8M尿素）； 溶解（6M盐酸胍）和 不溶解（6M盐酸胍） 溶解（1%2%SDS） 和 不溶解（1%2%SDS） 挂柱 和 不挂柱（2） 当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度和量达标时，可进行复性透析试验。复性透析试验正常（浓度达标），可进行分装；复性透析试验不正常（浓度不达标），要么浓缩（离心或甘油），要么重新取样将蛋白浓度控制高一点；复性透析试验不正常（出现沉淀），要检查透析时的浓度，复性透析Buffer，PH值是否正常，是否加入肌氨酸钠等，不正确要

6、改正，并结合参考文献和客户的要求，以确定最终的复性透析条件。（3） 当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度达标时，但是量不够时，可重新接大瓶后再次纯化以达到所需的量。与此同时可将先纯化得到的不足量的蛋白去做复性透析小试，以便为此后的足量蛋白复性透析摸索条件。（4） 当8M尿素溶解好的蛋白挂柱时，纯化所得的蛋白纯度不达标时，先判断是否是洗脱时洗脱Buffer的梯度选择有问题，或者是梯度没有洗脱彻底。如果是上述原因，可将样品再次挂柱，选择最佳洗脱梯度并洗脱彻底。或者将不纯的样品挂离子柱，若纯度达标则进行下一步操作，若纯度还不行，可将不纯的样品过分子筛，若多种纯化方式结合后纯度依然不达标，

7、要么与客户沟通，要么终止实验。（5） 当8M尿素溶解好的蛋白不挂柱时，目标蛋白带标签的要考虑一下标签是否正常。通过Western blot等方法检测标签是否正常，如果标签正常，有可能是蛋白的标签没有暴露，可以加入足量的还原剂等使其标签暴露，也可以通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；如果标签不正常，有可能是在样品处理时将其所带的标签断裂，其与不带标签的蛋白处理方法一样，通过挂离子柱和过分子筛来纯化蛋白；以上的方法纯化的蛋白纯度达标可进行下一步，若已经通过组合纯化的方式纯度不达标，要么与客户沟通，要么终止实验。（6） 当8M尿素不溶解蛋白（溶解率低），首先分析是否是在处理样品时没有研磨充分，如果研磨不充分，会导致蛋白胶质化，难以溶解。如果研磨充分，还是不溶解，就该用溶解性更高的6M 盐酸胍溶解。（7） 如果6M 盐酸胍溶解蛋白充分，下面的步骤和8M尿素充分溶解蛋白的步骤一样。（8） 当6M 盐酸胍不溶解蛋白（溶解率低），若是操作原因可改正，若不是操作原因，需要用溶解性能更高的1%2%SDS溶解。（9） 如果1%2%SDS溶解蛋白充分，下面的步骤和8M尿素充分溶解蛋白的步骤一样。（10） 如果1%2%SDS不溶解蛋白（溶解率低），若能从低溶解率的蛋白溶液中纯化得到