羊肚菌多糖的初级分离纯化

1、羊肚菌多糖的初级分离纯化摘要摘要:目的 研究羊肚菌多糖的分离纯化。方法 通过超声水提醇沉的方法提取其多糖，经水提得到的羊肚菌粗多糖通过脱色，Sevage法进行脱蛋白，经DEAE-52离子交换柱层析，用纯水、0.1、0.3、0.5、0.7molL-1 NaCl溶液和0.1、0.3、0.5molL-1 NaOH溶液进行阶段洗脱。结果 得到六种组分TAP-1、TAP-2、TAP-3、TAP-4、TAP-5、TAP-6，其得率分别是24.56%、18.72%、2.32%、15.08%、6.57%、2.48%。结论 得到不同的多糖，其中中性多糖占上样量的24.56%，酸性多糖占上样量的42.69%，碱性

2、多糖占上样量的2.48%。关键词：羊肚菌；多糖；分离纯化AbstractAbstract: Objective To study the isolation and purification of Polysaccharides from morchella. Method by ultrasonic water provided alcohol precipitation method for extraction of the polysaccharide, with water provided from Morchella polysaccharide by decoloration,

3、 Sevage method of removing protein and by DEAE-52 ion exchange chromatography, the pure water, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7mol - L-1 NaCl solution and 0.1, 0.3, 0.5 mol - L-1 NaOH solution phase elution. Results six components TAP-1, TAP-2, TAP-3, TAP-4, TAP-5, TAP-6, the yield was 24.56%, 18.72%, 2.32%, 15.0

4、8%, 6.57%, 2.48%, respectively. Conclusion polysaccharide from different, which accounted for 24.56% of the amount of neutral polysaccharides, acidic polysaccharides accounted for 42.69% of the sample, the amount of alkaline polysaccharide accounted for 2.48%.Keywords: Morchella essulenta;polysaccha

5、ride;separation and purification目录引言11材料与设备11.1材料与试剂11.2仪器12方法22.1羊肚菌实体多糖的提取22.2羊肚菌多糖的脱色22.3羊肚菌多糖的醇沉22.4羊肚菌多糖的脱蛋白22.5 羊肚菌多糖的离子交换柱层析22.6离子交换柱的后处理33实验结果与讨论33.1结果33.2讨论44结论4参考文献5致谢6引言羊肚菌(Morchellaesculenta)隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella),因其菌盖表面

6、呈许多小凹坑,外观极似羊肚而得名1。羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌,最早收录于李时珍的本草纲目。中医认为其性平,味甘寒,无毒,具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾、壮阳、补脑、提神之功能2。现代研究发现,羊肚菌具有很高的营养和药用价值,特别是羊肚菌多糖有降血脂、调节免疫功能、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用,并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用3。对多糖的分离提纯，国内外常采用有机溶剂沉淀法和柱层析分离法。本文通过超声，超速离心，有机溶剂沉淀、离子交换柱层析的的方法对羊肚菌多糖进行了分离提纯。1材料与设备1.1材料与试剂 羊肚菌2015年5月采于青海省互助北山林场，经卢教授鉴定为正品；苯酚（分析纯

7、，天津市大茂化学试剂厂）；浓硫酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；氯化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；氢氧化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；浓盐酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；95%乙醇（分析纯，天津市白银良友化学试剂有限公司）；正丁醇（分析纯，天津市富宇精细化工化学有限公司）；三氯甲烷（分析纯，天津市富宇精细化工化学有限公司），DEAE-52（分析纯，北京满仓科技有限公司）；火棉胶（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。 1.2仪器 AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；FZ102粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）；TD3低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限

8、公司）；DHG-9140B电热恒温鼓风干燥箱（上海琅玕仪器设备有限公司）；R-215旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；HSB-3循环水式真空泵 （郑州杜仪器厂）；T6新悦紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DBS-100自动部分收集器（上海沪西仪器厂）；FOU-1100冷冻干燥器(上海爱朗仪器有限公司)。2方法2.1羊肚菌实体多糖的提取羊肚菌干品粉碎过20目筛，称取1000g，超声提取，超声功率80W，提取时间1h，料液比2:1，提取2次，提取羊肚菌多糖，趁热用纱布过滤并收集滤液，滤液于4000rpm离心15min，离心后合并上清液，并用旋转蒸发仪浓缩至总体积约200 mL4。2.2

9、羊肚菌多糖的脱色D354FD树脂预处理:取一定体积的树脂，先用510倍体积的蒸馏水浸泡，并使用蒸馏水反复冲洗，去除机械杂质和破碎的树脂细粒，纱布过滤后树脂用5%HCl溶液浸泡3h，后用蒸馏水反复洗涤至中性，再用5%NaOH溶液浸泡3h，再用蒸馏水洗涤至流出水为中性5。按照体积比1:1往多糖浓缩液中添加经过预处理的D354FD树脂，放置50水浴锅中水浴3h，并间隔搅拌，然后抽滤除去树脂，并用少量水洗涤树脂，合并洗涤液即为经过脱色的多糖溶液6。2.3羊肚菌多糖的醇沉往脱色后的多糖溶液中缓慢添加4倍95%乙醇，同时不断搅拌，至使多糖均匀沉淀，添加乙醇至混合液中乙醇浓度为70%，置4冰箱中放置16h。

10、之后将糖醇混合液转移至离心管，4000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀于50烘箱烘干，得羊肚菌粗多糖干品。2.4羊肚菌多糖的脱蛋白Sevag试剂的配制:取三氯甲烷和正丁醇，以5:1体积比进行混合，放置棕色瓶中备用7。Sevag法脱蛋白，取一定量的羊肚菌粗多糖干品，添加适量蒸馏水溶解混匀，糖溶液和Sevag 试剂按照4:1的体积进行混匀，搅拌20min，转入离心管，4000r/min离心10min。混合液分为三层，其中上层为多糖溶液，弃去中间层变性蛋白和下层有机溶剂，重复操作15次。往脱蛋白后的多糖溶液中添加4倍95%乙醇按照2.3步骤进行醇沉，醇沉离心后于50鼓风干燥箱中烘干，最终得

11、到羊肚菌粗多糖干品（TAP）备用8-9。2.5 羊肚菌多糖的离子交换柱层析DEAE-52的预处理：取40gDEAE-52，用510倍蒸馏水浸泡溶胀，于4冰箱中放置过夜。然后小心倾倒上层水分，同样用510倍0.5molL-1HCl溶液浸泡1h，过滤弃去溶液并用蒸馏水反复洗涤至中性，然后添加0.5molL-1NaOH溶液浸泡并用蒸馏水洗涤至中性10。经过处理的DEAE-52装入2.620cm层析柱中，装的过程中避免产生气泡使填料柱不均匀，用恒流泵泵送蒸馏水洗脱，调整使其平衡使最后流速为0.5mL/min，流速稳定后用蒸馏水洗脱24h 11。称取羊肚菌粗多糖干品（TAP）300mg，加蒸馏水溶液配制

12、成10mgmL-1的粗多糖溶液，经过离子交换柱层析，依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5、0.7molL-1 NaCl溶液和0.1、0.3、0.5molL-1NaOH溶液洗脱，10min/管，自动收集器收集，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线并按峰收集12。将收集到的羊肚菌多糖溶液分别浓缩至小体积，流水透析24h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，得到初步纯化的6个部分羊肚菌多糖TAP-1、TAP-2、TAP-3、TAP-4、TAP-5、TAP-6，计算各部分多糖得率，计算公式： 多糖得率=各级多糖质量 /上样多糖质量100%2.6离子交换柱的后处理用0.7molL-1NaCl洗脱以后，直接用1

13、molL-1NaCl洗脱2-3个体积，然后用蒸馏水洗脱至中性，再用1molL-1HCl洗脱2-3个体积，最后用蒸馏水洗脱至中性，置于原来的容器，加入一定量的乙醇搅拌，等澄清后倒出乙醇，反复几次，水除去后，加少量乙醇，密封保存，待用。3实验结果与讨论3.1结果离子交换柱层析是以离子交换剂为固定相，不同的多糖有不同的分子大小和电荷排列方式，依据其与离子交换剂亲和力的不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或pH使多糖大分子再从离子交换剂上依次被洗脱下来。 图1羊肚菌实体多糖的离子交换柱层析洗脱曲线 羊肚菌实体多糖的DEAE-52离子交换柱层析，采用不同浓度梯度的NaCl（01molL-

14、1）溶液和NaOH（00.5molL-1）溶液对离子交换柱层析进行洗脱，同时苯酚-硫酸法跟踪检测各个组分多糖含量，结果见图1，得到六个组分，其中蒸馏水洗脱出第一个组分，记为TAP-1，含量占上样量的24.56%，0.1molL-1NaCl溶液洗脱得到第二和第三个组分，记为TAP-2和TAP-3，含量占上样量的18.72%和2.32，0.3molL-1NaCl溶液洗脱得第四个组分，含量占上样量的15.08%，0.5molL-1NaCl溶液洗脱得第五个组分，含量占上样量的6.57%，0.1molL-1NaOH溶液洗脱得到第六个组分，含量占上样量的2.48%。3.2讨论多糖的分离纯化十分复杂,要得到

15、均一的活性多糖组分并不容易,这就是阻碍多糖研究进展的主要原因。多糖的分离纯化方法很多,必须根据多糖的性质巧妙地选择正确的分离纯化方法，本实验所用离子交换柱层析的方法对羊肚菌多糖进行了初步的分离纯化，所分离的多糖含量与已有的研究报道结果有一定的差异，这可能跟原材料、提取方法及测定方法有所不同相关。 4结论DEAE-52纤维素对羊肚菌多糖进行初步分级，用蒸馏水、0.1molL-1NaCl、0.3molL-1NaCl、0.5molL-1NaCl、0.1molL-1NaOH五种洗脱液分步洗脱，共得到六个洗脱峰，分别为羊肚菌中性多糖TAP-1 ，酸性多糖TAP-2、TAP-3、TAP-4、TAP-5和碱

16、性多糖TAP-6，而TAP-6含量很低。由于时间及条件限制，只做了初步的分离纯化，故可进行后续的分离纯化和活性研究 。参考文献1李华,包海鹰,李玉.羊肚菌研究进展J.菌物研究,2004,2(4):53-60.2孟超,史洪舰,赵静等.富硒羊肚菌多糖提取工艺的研究J.中国西部科技,2013,12(2):83-84.3李娟,王臻,姚良同等.羊肚菌多糖研究进展J.微生物学杂志,2005,25(4):89-91.4武秋立,安家彦.羊肚菌多糖提取分离条件的选择J.食品科学,2005,26(1):116-118.5杨强,李新华,林子木.银杏果多糖树脂脱色工艺J.食品与发酵工艺,2012,38(12):107-110.6吴金松,郑炯,夏雪娟等.大叶麻竹笋多糖分离纯化工艺J.食品科学,2015,36(2):80-84.7方积年,丁侃.天然药物多糖的主要生物活性及分离纯化方法J.中国天然药物,2007,5(5):338-347. 8薛丹,黄豆豆,黄光辉等.植物多糖提取分离纯化的研究