动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告

1、动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（DNA ，为英文 Deoxyribonucleic acid的缩写），又称去氧核糖核酸， 是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分， 同时也是组成基因的材料。 有时也被称为“遗传微粒”， 原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己 DNA 的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。DNA 是高分子聚合物， DNA 溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。 DNA 对紫外线（ 260nm ）有吸收作用，利用这一特性，可以对 DNA 进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的

2、水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起 DNA 分子变性，即 DNA 双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开也称为 DNA 的解螺旋。在细胞内， DNA 能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言，正常的体细中含有46 条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为： G1 期-DNA 合成前期、 S 期-DNA 合成期、 G2-DNA合成后期。对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物， 如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将 DNA 进行组

3、织并压缩，以帮助 DNA 与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。脱氧核糖核酸的结构DNA 的结构：DNA 的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA 是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP脱氧腺苷）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （dTMP脱氧胸苷）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP脱氧胞苷）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（ dGMP脱氧鸟苷）。而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA 长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。

4、读取密码的过程称为转录，是以DNA 双链中的一条单链为模板转录出一段称为 mRNA （信使 RNA ）的核酸分子。DNA 是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3 ， 5 - 磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA 含有两条这样的长链，也有的 DNA 为单链，如大肠杆菌噬菌体 X174 、G4、M13 等。 DNA 有环形 DNA 和链状 DNA 之分。在某些类型的 DNA 中， 5- 甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶， 其中小麦胚 DNA 的 5- 甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中，5- 羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40 年代后期，查加夫（E.Chargaff ）发现不同物种 DNA 的碱

5、基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T ），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C ），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA 的结构。浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白 （DNP/RNP ）的形式存在，其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M 的盐溶液中溶解度很低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl 溶液将其从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的 DNP 用 SDS 处理可将其分离 DNA 和蛋白质，用氯仿 - 异戊醇将蛋白质沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞

6、组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有 25 亿个肝细胞， 5000 个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有 50 万个。肝细胞为多角形，直径约为 20-30/ 加(微米 )，有 6-8 个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。 每个肝细胞表面可分为窦状隙面、 肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构 :如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1. 掌握浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白（DNP/RNP ）的形式存在，

7、其中 DNP 能溶于水及高浓度盐溶液，但在 0.14 M 的盐溶液中溶解度很低，而 RNP 则可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的 NaCl 溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP 用 SDS 处理可将其分离DNA 和蛋白质，用氯仿 - 异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。四、实验器材和材料试剂实验器材：匀浆器量筒离心机离心管试管吸管恒温水浴锅实验材料：猪肝实验试剂：0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）95% 乙醇（ A.R.）NaCl 固体（ A.R.）5%SDS 溶液（ 5g SDS定容至 100ml）V(氯仿

8、 )：V（异戊醇） 20 ：1 的混合液五、实验操作1. 称量 称 取 一 定 质 量 的 猪 肝 ， 加 入 2 倍 肝 重 的 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎（已完成）。2. 提取DNA量取肝糜4 ml于10毫升离心管，在4000r/min下离心10min，沉淀中再加入8 ml缓冲液于4000r/min离心5 min；弃上清，取沉淀；将沉淀用10 ml 柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、加入 5 ml 氯仿 - 异戊醇混合液、1 ml SDS ，振荡 30min（保鲜膜封口）；缓慢加入固体 NaCl （约 0.9g ），使其最终浓度为 1mo

9、l/L ；将溶液分装到 2 个 10 毫升离心管中，在 4000r/min 离心 5min ，取上清水相；在上述水相溶液中分别加等体积冷95% 乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动， 将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得 DNA 粗品；用 8ml 蒸馏水溶解 DNA 粗品于 10ml 离心管中。3. 标准曲线的绘制按下表加入各种 试剂，混匀，于 60 恒温水浴锅 45min ，冷却后，在 595nm 波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对 DNA 浓度作图，制作标准曲线。012345标准 DNA溶0.00.40.81.21.62.0液/ml蒸馏水 /ml2.01.61.20.80

10、.40二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.0/mlA595nm4. 样品的测定将 DNA 粗品定容至 25ml容量瓶，再取 DNA 样液 1.0ml ，加入蒸馏水 1.0ml ，混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml ，混匀，于60 恒温水浴锅 45min ，冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA 的质量（ ug ）。5. 计算 100g 猪肝中 DNA 含量 w=m1/m2 100%w ：DNA 的质量分数（ %）m1 ：样液中测得的DNA 的质量（ ug ）m2 ：样液中所含样品的质量（ug ）六、实验数据处理1. 标准曲线012345

11、标准 DNA溶0.00.40.81.21.62.0液/ml蒸馏水 /ml2.01.61.20.80.40二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.0/mlA595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA 含量080160240320400/ug2. 实验结果处理猪肝质量为 2.04gDNA 提取液体积为 12.53ml序号123A595nm0.1020.1020.101平均 A595nm0.102样液中 DNA 含量 /ug171.4样液中样品质量 /g0.1628根据公式w=m1/m2100%得： w=0.1053 则 100g 猪肝中 DNA 含量为： w 100=0

12、.1053g七、思考题1. 实验中的乙醇、 SDS、氯仿 - 异戊醇、 NaCl 、柠檬酸钠分别有什么作用？答：柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH 缓冲溶液； SDS 是表面活性剂，可以让蛋白质与 DNA 分开；氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀， 便于分离出去；异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；氯仿 - 异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；NaCl 固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中 DNA核蛋白能溶解， RNA 核蛋白则溶解度很低，可以利用这一性质分离两种核酸。八、实验注意事项1.DNA主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提

13、取制备DNA 的材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而 DNA 含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中 DNA 被降解的可能性相对较低，所以是制备DNA 的良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备DNA 常用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。2. 为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：整个过程必须在低温下进行， 可加入某些物质抑制核酸酶的活性， 如柠檬酸钠、 EDTA、SDS 等， EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。3. 从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：氯仿 - 异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解

14、聚，并释放出核酸。4. 使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。5. 避免剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。九、实验结果误差分析及讨论经过对本次实验结果进行分析，得出100g 猪肝中 DNA 含量大约为0.1053g 的结论，在上网查阅相关资料后发现：猪肝中 DNA 含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。 由此可知，本次试验结果是相对比较成功的，较为粗略地测量出猪肝中 DNA 的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取 DNA 的原理与技术，基本达到了本次实验的目的。但是本次实验结果只是粗略测量，并未达到精确测量猪肝中DNA 的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于

15、某些误差导致，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：在称取猪肝后加入柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中， 由于猪肝组织表面较滑不易磨碎， 且研磨至最后依旧有小部分猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中 DNA 提取不充分，致使实验数据较理论值偏低；研磨过程中， 可能由于操作不当，导致部分液体溅出，因此可能使得提取液中部分DNA 损失，导致实验数据偏低；在粗提取 DNA 操作中，频繁地将 DNA 提取液转移至各个仪器内，可能有极小部分 DNA 提取液未倒净，残留在仪器壁上损耗掉，导致实验误差；在使用移液枪的过程中， 可能因为操作不当或移液枪经常错误使用，出现仪器误差， 导致吸取的 DNA 样液不精确，出现实验误差；在水相中加入乙醇析出 DNA