总RNA的提取和检测 实验报告

1、总rna的提取和检测 实验报告实验二 总rn的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总rna的方法；2.熟悉紫外吸收法检测ra浓度与纯度的原理及测定方法；3掌握rna琼脂糖凝胶电泳方法并分析总rna的电泳图谱;实验原理(一）概述10-5 g na/细胞含有rn 80-5：18s rna， rna 1-15% rna12 mrna 3端存在20-50个多聚腺苷酸(pola) 结构，可用olio(dt)亲和层析柱分离mrna。3.rna分离的方法:异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶k-细胞质rn提取法、异硫氰酸胍酚-氯仿一步法等。4.目前常用的是triz

2、l法。(二）trizol的主要成分1trizol是一种新型总ra 抽提试剂,主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质,其主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。2.酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制rn酶活性,因此trzol中还加入了羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源ra。3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相,rna在上层水相中。4取出水相用异丙醇沉淀可回收r;用乙醇沉淀中间层可回收na。(三)总n的纯度检测原理： 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收,光能量被吸收的程度和物质

3、的浓度有一定的比例关系。rna在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。 因此，可以用260波长分光测定rna浓度,od值为1相当于大约0gl 的单链na。用ph=.6的e（rishcl缓冲液)稀释rna样品倍并以e为空白对照,根据此时读出的 260 值即可计算出样品稀释前的浓度：rna (gml)= 4d20读数稀释倍数（n)/1000实验步骤（一）样品处理与trio用量.提取组织rna时,每00mg组织（即00.50.5cm,约合0.1c3)用ml izol试剂对组织进行裂解;.悬浮细胞先离心沉淀，每5-1010个细胞加mtril后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。.培养贴壁细胞不须消化，

4、可直接用tril进行消化、裂解,trizol体积按10cm2/ml比例加入。(注意:匀浆一定要彻底,是提取高质量rn的前提；细胞数量与trizl的比例，细胞的数量不能过多。)（二)操作步骤1.细胞中加入1 mltriol用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后,室温放置mn，使其充分裂解。（注意:此时可放入-70长期保持)2按200 氯仿m trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-in。(注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和trol不分层)3. 412，000g离心5-10mn。样品分为三层：底层为黄色(红或绿)有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中,水相体积约为所用triz试剂的60

5、。4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般00-40l就足够了,千万不要贪多!（注：千万不要吸取中间界面)5.加入与水相等体积异丙醇后，上下颠倒混匀,放置5 min。7.412,00离心1 mi,弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。.加入1 ml 5%乙醇,(在沉淀对面管壁加入,切勿触及沉淀！）盖紧盖子后，温和转离心管周,充分润洗管壁。.412,00g离心5 min,尽量弃上清。0.室温晾干或真空干燥5 mn。（注：rna样品不要过于干燥，否则很难溶解）11.加入适量冰冷无rnase的ppc水(一般10 -2l），充分震荡混匀，瞬时离心，备用。(三)检测步骤1.将提取的rn,按:20加入te进行稀释2.稀释过后用分光光度仪进行检测，先使用te行进校对,空白对照,所有样品要先润洗三次之后，再加入50样液进行检测3