毕赤酵母的培养基1

1、.毕赤酵母的培养 巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化钠 1% PH 7.0-大肠杆菌培养 制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。 用于培养 pPICZ A 原核宿主菌 TOP10F时可加入 Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -诱变造成的。MD-酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13

2、.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。MM-酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“ ”来表示。不同微生物的基本培养基是不相同的。2 LLB 培养基 胰蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化钠 0.5% PH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。 121高压灭菌 20min。 可于室温保存数月。 用于培养 pPICZ A 原核宿主菌 TOP10F

3、时，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4条件下保存 12 周. 3 YPD培养基 酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂 YPD 平板在 4可保存 几个月。加入 Zeocin 100ug / ml，成为 YPDZ 培养基，可以 4条件下保存 12 周。4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%， 磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（410 -5 ）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一 般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉

4、BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。5 BMMY培养基 酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB 1.34% 生物素（410 -5 ）% 甘油1% 甲醇3%，毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotin过滤除菌。摇瓶培养时每24小时 之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。6 YPDS + Zeocin 培养基 酵母粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖2%，山梨醇1M, 琼脂2%，博来霉素100mg/ml 不管是液体 YPDS 培养基，还是 YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放 4条件下，有效1-2周。7 MGY培养基 34%YNB,1%

5、甘油，410 -5 %生物素，将 800ml 灭菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml 的 500*B 母液和 100ml 的 10*GY 母液混匀即可，4保存，保存期为 2 个月。8 MGYH培养基 MGY培养基+0.004%的组氨酸 MGYH 在 1000ml 的 MGY 培养基中加入 10ml 的 100*H 母液混匀，4保存，保存期为 2 个月。9 RD -5 Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基） （含有：1mol/L 的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10 %生物素；0.005%氨基酸） （1）. 将 186g 的山梨醇定

6、容至 700ml，高压灭菌；（ 2）. 冷却后于 45水浴； （3）. 将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 无菌 水混匀，预热至 45后，与步骤 2 的山梨醇溶液混合。4保存。 10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸） 在 RD 培养基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H 母液，同时无菌水的体积减少至 78ml 即可，其余配制方法与 RD 相同。4保存。11 RD 及 RDH 平板的制备

7、1. 将 186g 的山梨醇和 1520g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴； 2. 参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4， 100ml 的 10*D、 将 100ml 的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45 后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀； 3. 迅速制备平板。4可保存数月。12 RD 及 RDH 的 TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被） 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被） （1）.将 186g 的山梨醇和 7.510g 琼脂粉定

8、容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴； 琼脂粉 60 （2）.参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4， 100ml 的 10*D、 将 100ml 的 10*YNB； 的 500*B； 2ml 10ml 的 100*AA 等母液、 （10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45后， 与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀； （3）.将该 TOP 琼脂置于 45水浴冷却、保温，备用。13 MD 与 MDH -5 Minimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸） （含有：1.34%Y

9、NB； ；4*10 % 生物素；2%葡萄糖） 1. 100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至 1000ml 即可； 2. 如配制 MDH，可在上述的 MD 中加入 10ml 的 100*H 即可； 3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入 1520g 的琼脂。4可保存数月。14 SOC 培养基： 培养基： Trypton Yeast Extract NaCl Glucose (1mol / L) 121高压灭菌 20min，冷却后，4保存。 l 0.5 0.05 2% 母液的配置注： 母液的配置注： 10*YNB （含有

10、硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 4保存。34g 酵母 基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g 硫酸铵，溶于 1000ml 水中，过滤除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期为 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，过滤除菌。 100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4保存 保存期为 1 年。400mg 的 L-组氨酸溶于 100ml 水中， （加热至 50以促进溶解） ，过滤除菌。 10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中，灭 菌 15min 或过滤除菌。

11、10*M 过滤除菌。 （5%Methanol 甲醇） 保存期为 2 个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀， 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为 1 年以上。将 100ml 甘油和 900ml 水混匀 后，高压灭菌或过滤除菌。 100*AA 过滤除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4保存 保存期为 1 年。分 别将 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和 L-异亮氨酸溶于 100ml 水中， 1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0） ，将 1mol/L 的 K2H

12、PO4 溶液 132ml 与 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混匀，其 pH 为 6.0，如需调节 pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节 pH。10*YNB:34g 酵母 基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g 硫酸铵，溶于 1000ml 水中，过滤除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期为 1 年。20mg 的生物素 溶于 100ml 水中，过滤除菌。100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4保存 保存期为 1 年。400mg 的 L-组氨酸溶于 100ml 水中， （加热至 50以促进溶解） ，过滤除菌。10*D （20%Dextrose

13、葡萄糖） 保存期为 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中，灭 菌 15min 或过滤除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为 2 个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀，过滤除菌。 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为 1 年以上。将 100ml 甘油和 900ml 水混匀 后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA 过滤除菌。 （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4保存 保存期为1 年。分 别将 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和 L-异亮氨酸溶于 100ml 水中过滤除菌。 1M磷酸钾溶

14、液（potassium phosphate buffer，pH6.0） ，将 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml 与 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混匀，其 pH 为 6.0，如需调节 pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶1（AOX1）基因的启动子 和转录终止子（5AOX1 和 3AOX1） ，它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基 因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及 3AOX1 区。当整合型载体转化受体时，它的 5AOX1 和 3AOX1 能与染色体上的同源基

15、因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上， 外源基因在 5AOX1 启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由 89 个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号 交配因 子(-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。 分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZ A，pYAM75P 等。胞内表达载体主要 有 ： pHIL-D2 ， pA0815 ， pPIC3K ， pPICZ ， pHWO10 ， pGAPZ ， pGAPZa(Invitrogen)， pPIC3.5K 等。工程菌株 Y114

16、30，MG1003，GS115 （AOX1） KM71， ， SMD1168。 毕赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 两种， 都具有 HIS4 营养缺陷标记。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是 Mut，即 表型为 Muts， 甲醇利用正常型； KM71 菌株的 AOX1 位点彼 ARG4 基因插入， 而 即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的 获得方式： 与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以 有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可 通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可

17、通过连接产生外源 基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用 SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高 的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法： 酵母系统表达的蛋白一般都具 有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利 于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进 一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。2. 毕赤酵母利用的优缺点分析 Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记