基因操作的基本步骤

1、.,三、基因操作的基本步骤,.,从细胞中分离出DNA,从大肠杆菌中提取质粒,提取目的基因,目的基因与运载体结合,DNA连 接酶,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与表达,三、基因工程操作的基本步骤,.,.,基因操作“四部曲”即四个基本步骤：,1）提取目的基因,2）目的基因于运载体结合,3）将目的基因导入受体细胞,4）目的基因的检测和表达,.,步骤一：提取目的基因,目的基因是人们所需要转移或改造的基因, 获取目的基因是实施基因工程的第一步 。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,.,目的基因的提取方法,直接分

2、离基因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法,.,1 . 鸟枪法（散弹射击法） 用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。,.,（2）基因文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,方法一：直接分离法(鸟枪法),.,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA

3、为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,2.人工合成基因法,.,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,.,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基

4、因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,.,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪： 2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,.,.,步骤二：目的基因与运载体结合,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重

5、组的过程。,.,.,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：将目的基因导入受体细胞,.,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 （1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 （1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DN

6、A分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。 （2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。 （3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。,.,1.将目的基因导入植物细胞,.,2.将目的基因导入动物细胞,.,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,例如：将目的基因导入微生物细胞,.,步骤四：

7、目的基因的检测和表达,检测是否导入：,看标记基因控制的性状是否表现,.,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,检测是否表达：,看目的基因控制的性状是否表现,.,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并

8、得到表达。,.,.,1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,.,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,.,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,.,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为