血培养VS分子生物学解析.ppt

1、2020/11/8,血培养,VS,分子生物学,血流感染快速分子诊断,分子诊断不受抗菌药物使用的影响 血培养阳性后分子诊断 直接使用血标本进行分子诊断 快速但不能提供药敏结果,血培养阳性瓶分子鉴定,Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测 病原特异性PCR 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数 广谱检测：PCR扩增特定靶位 多态性分析 测序 后续基因检测 种特异性real-time PCR,Expert

2、 Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.2011, 24(2):137,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,5,Target：ecfX gene 血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b 对照方法：氧化酶，API 20E DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 扩增：Oligonucleotide primers 基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin

3、 Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,6,33瓶pae，敏感性和特异性均为100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，PCR(-) 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,阳性血培养基于PCR的检测,最常见病原体多重PCR 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany):

4、多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成 多重Real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交,

5、10,血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH,革兰阴性菌： 商品化试剂盒eco/kpn/pae Efa/其它肠球 Sau/scn Cal/cgl/其它念珠菌 报道Salmonella spp. 90min PNA FISH完成,Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301 J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,MALDI-TOF MS,基质辅助激光解析电离（MALDI） 原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，

6、使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基质,MALDI-TOF MS,飞行时间（TOF） 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步骤,MALDI

7、-TOF MS快速鉴定阳性血培养,14,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定 快速：20分钟(从报警到鉴定出结果） MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD): 正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%) 80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spn MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux): 388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌） 15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌,Clin Microbiol Inf

8、ect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,MALDI-TOF MS,15,VITEK MS(bioMrieux) 以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率 肠杆菌科97.7% 非发酵菌92% 葡萄球菌属94.3% 链球菌属84.8% HACEK84% 酵母菌85.2%,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,广谱PCRESI MS（电喷射质谱） 189阳性血培养和45阴性血培养，一致率98.7% 6例spn标本方法阴性 提供定量结果评估病原体载量 假阴性率24%：几乎均由混合感染导致

9、 5-6h完成检测 结合PCR的敏感性和ESI MS特异性 可以直接检测标本，不需要培养,Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血标本分子检测,种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析 血培养阴性的苛养菌，如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiella burnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体，Tropheryma whipplei,商品化分子生物学检测方法:血标本,18,SeptiFast(Roche)：multiplex real-

10、time PCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌 SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌 VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段 Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,Intensive Care Med. 2011

11、 May, publish online.,SeptiFast test检测的病原谱,BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast test评估,Intensive Care Med (2010) 36:4956,SeptiFast与PCT、CRP相关性,Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447455,VYOO检测能力评估,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,Sepsis,非感染SIRS,血培养阳性,血培养阴性，其它标本培养阳性,Sepsis,所有培养阴性,V

12、YOO,与微生物学一致性为46.2% 仍需改进,PLoS ONE. 2012,7 : e38916,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,3种商品化PCR检测系统比对,Med Klin Intensivmed Notfmed 2013,分子生物检测血标本,26,几乎所有与血培养对照的研究，都显示更高的敏感性，但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来 不可替代血培养！ 相较于血培养，其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗，或改变治疗方案 污染导致的假阳性无法排除！ 评估血培养阴性的PCR阳性结果 分析其它微生物检查结果（如BALF，伤口拭子等） 免疫反应指标,I