肝病的病理形态特点及免疫组化染色体会ppt课件.ppt

1、常见肝病的病理形态特点及免疫组化染色的几点体会,复旦大学病理学系 张锦生,1,肝穿刺标本检查和处理原则,1. 肉眼观察 肝穿刺标本呈完整园柱状，长度13 cm 典型的慢性肝炎肝纤维化标本呈竹节状外观 肝硬化的穿刺标本，呈不规则碎块,2,2.石蜡切片 每张玻片上应放置超过6个连续组织切片，有助于肝纤维化的病理诊断。,3,3. 染色 除常规染色供病理诊断用之外，根据条件 和需要作以下特殊染色： 网状纤维染色， Masson三色染色， 胶原纤维染色(Sirius red或免疫组化 ),4, Dm-HSC -SMA-MFb,Dm,-SMA,5,S1,S2,S3,S4,各种病因引起肝纤维的病理学特点及分

2、期 1. 慢性肝炎肝纤维化 ( Dr.Scheuer 方案）,6,活动性纤维间隔静止性纤维间隔,7,脂肪性肝病肝纤维化 穿刺肝组织呈淡黄色，标本悬浮于固定液,小叶中央区纤维化窦周纤维化,8,3. 肝糖原累积病肝纤维,9,4. Wilson病,红氨酸(Rubeanic acid)染色,铜被染成深绿色,10,5. 血色病 穿刺肝组织因含有大量含铁血黄素沉着呈火焰红色,肝细胞普鲁氏蓝染色阳性,11,6. 自身免疫性肝炎肝纤维化（AIH） 门管区肝细胞呈花环状排列Hepatic Rosette ，表现为数个水样变性的肝细胞被炎症细胞和塌陷的网状支架包绕成花环状结构。,12,7. 原发性胆汁性肝硬化（P

3、BC） 3期（间隔期）90%出现自身抗体(A-Mit)，Florid duct lesion+Biliary PN， 纤维间隔形成，肝细胞羽毛状变性 4期（肝硬化） 静止- 纤维间隔内无炎症或轻度炎症 活动 Fibrous PN.,13,8. 血吸虫性肝纤维化,14,肝癌(LIVER CANCER),HCC ICC Combined hepatocellular and cholangiocarcinoma,15,肝癌病理诊断常用免疫组化和特染,Hep Par1 线粒体相关抗原，与AFP无关 对胎儿和成人肝细胞高度特异 (HCC:阳性率82-97%）,16,AFP HCC阳性率：15-82%,

4、17,CD34: HCC型染色 长条分枝，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫.而非癌肝组织内极少见.,18,CK 18: HCC,ICC, Metastatic carcinoma:100%+ 上皮性肿瘤标志物,19,CK 19: 胆管型CK: CK19,CK7 肝细胞 胆管上皮，ICC：77-100% ICC最好的标志物,20,CEA： monoclonal CEA:毛细胆管 ICC，转移性肝癌：60-75%+ HCC:0-11%+ polyclonal CEA: 毛细胆管 HCC特异标志物之一,21,CK 20: 胃肠道腺癌的主要标志物 转移性腺癌：74-100%+ ICC:10%+ HCC

5、:0%+,22,MOC31: 抗人上皮相关抗原 转移性腺癌：100%+ ICC: 92.9%+ HCC: 0% + 胃癌肝转移,23,HBsAg: HCC: 70-80% +,胞质型，胞核型阳性,胞质型，核周型阳性,24,黏液染色：AB/PAS 酸性黏多糖：兰色（胆管腺瘤,ICC腔内黏液） 中性黏多糖,糖原：红色（假腺管型HCC),25,免疫组织化学染色的几点体会,一、组织和细胞标本制备 目的： (1)最大限度地保存组织结构。 (2)最大限度地保存抗原性。 注意事项：在选择组织处理方法前，先根据实验目的，参考抗体说明，确定组织处理方式(冰冻?石蜡?)。,26,1.取材,（1）原则：尽可能新鲜，

6、动物标本可选 用动脉灌注固定。 （2）取材部位：尽量包括病灶和正常组 织交界处，避免选择坏死组织。 （3）避免挤压：受挤压组织不但影响 HE切片的观察，还造成非特异性 免疫组化组织着色。,27,2.固定,根据不同的染色目的，选择不同的固定液，固定时组织越新鲜越好。组织块厚薄大小要合适。 容器要大,固定液要宽余. 固定时间既要考虑充分固定,又不能太长(依组织块厚薄大小从24hr至35天,太长可溶性抗原会渗漏,阳性会减弱甚至转阴. 选择最合适的固定剂,如用福尔马林,必须用缓冲福尔马林,28,3.制备蜡块,冲水、脱水、透明、包埋。尽可能采用低温石蜡包埋,如无低温石蜡,可将组织块尽可能修薄,以缩短脱水

7、、透明、包埋时间,尽可能保存组织内抗原稳定。,29,4.制备冰冻切片,冷冻包埋能较好保存抗原,新鲜及已固定材料均适合于冷冻包埋、切片。 防止冰结晶! 预处理:目的是减少组织中的水分以减少冰结晶的产生,方法是将已固定、冲洗的组织块放入2030%蔗糖缓冲液内,4冰箱过夜,再将组织块埋于OCT包埋剂 速冻:目的是使温度很快下降迅速通过冰点,防止冰结晶产生。,30,速冻方法,液氮法:将OCT包埋的组织块投入液氮数秒,等组织块冻结后,立即移入低温冰箱(装入封口塑料袋内密封)或放入恒冷切片机恒冷箱内以备切片; 干冰-丙酮法:将200ml丙酮注入小型广口保温瓶或保温杯内,逐渐加入干冰至饱和不再冒泡为止,温度

8、可达-70;将装有50ml异戊烷的小烧杯缓慢置入干冰-丙酮饱和液中;然后将OCT包埋的组织块投入异戊烷内速冻半分至一分钟。,31,免疫组化染色后的衬染,常用苏木精或甲基绿衬染细胞核。但如果阳性信号在细胞核,切勿衬染细胞核! 细胞质衬染:1%亮绿,但退色较快,可改用坚固绿(FAST BLUE)染,则保存时间较长,32,封固和保存,绝大多数免疫酶染色后都可用树胶封固，但如用DAB以外的底物应注意有色沉淀物如为脂溶性，应改用水溶性封固物如明胶、甘油缓冲液等。 酶免疫染色切片可保存数周甚至数月。 免疫荧光染色后应尽快观察、拍照。,33,一.常用免疫组织化学方法,免疫荧光: 用于培养细胞效果较好, 石蜡

9、切片因常有自发荧光,背景荧光较强,用时要注意 FITC(异硫氰酸荧光素) 用450490 nm光激发,515nm 滤片观察, 呈翠绿色 RB200(四乙基罗达明B200) 用570nm光激发, 596 600nm滤片观察,呈橘红色 TRITC(四甲基异硫氰酸罗达明) 用530 560nm光激发,580nm滤片观察,呈红色 Texas red 用595nm光激发, 615nm滤片观察,呈红色 直接免疫荧光法: 间接免疫荧光法 双重荧光染色,34,2.免疫组织化学,常用方法: PAP ABC或LSAB ELPS(二步法),35,20世纪70年（1970）Sternberg Peroxidase-a

10、nti-Peroxidase (PAP),36,20世纪80年代（1981） 许世民 ABC（亲和免疫组化） Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,37,90年代中期：Enhanced Polymer One Step (EPOS) EnVision (Enhanced Labelled Polymer System, ELPS)简称二步法 1 mol 含 70 mol HRP + 10 mol AB,38,如何做好免疫组化染色?,什么才是高质量的免疫组化染色? 阳性信号突出 无背景染色 切片平整 无破裂/碎,无污秽,39,做好免疫组化染色几点体会,1.组织细胞处理: 固定剂 固定时间 速冻防冰结晶 白片质量好:平整,无破裂/碎,无污秽 防脱片 : 玻片绝对干净 涂粘合剂: 白胶 多聚赖氨酸 铬明矾明胶液 甲醛明胶液 贴片后冷风吹干或37 /60烘干,40,2.抗体:特异性,高效价,亲合力,适度稀释度 3.石蜡切片- 抗原修复 (1)蛋白酶消化: 胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K 胃蛋白酶 消化不足- 修复失败,假阴性或信号弱 消化过度- 结构破环,脱片 (2)热修复: 微波照射 高压加热 水浴加热 (3)微波+蛋白酶消化 注意点: 固定时间长,消化时间或热修复时间适当延长 酶生产厂家不一,或批号不一,消化时间可能也不一 热修复的