《植物生理生化》实验指导

1、植物生理生化实验指导（适用专业：农学类相关专业）黑龙江八一农垦大学植物科技学院生理生化教研室目 录生物化学实验部分：实验一、氨基酸的纸层析 1实验二、蛋白质含量测定（设计性实验） 5实验三、酶的基本性质 7实验四、维生素C含量的测定 12实验五、还原糖和总糖的测定 14实验六、淀粉酶活性的测定 17实验七、脂肪浸提索氏脂肪浸提法 20实验八、一种简单实用的提取植物DNA的方法 22实验九、聚丙烯酰胺电泳法测定大麦、小麦种子纯度 24实验十、淀粉酶的诱导、提取和活性测定（综合性实验） 26植物生理学实验部分:实验一、植物组织水势的测定（小液流法） 28实验二、植物伤流量的测定 30实验三、根系活

2、力的测定 31实验四、蒸腾强度的测定 35实验五、叶绿体色素的提取、分离、性质和定量测定（综合性实验） 37实验六、光合强度的测定（改良半叶法） 39实验七、呼吸强度的测定 41实验八、植物抗逆性的鉴定（电导仪法） 43实验九、植物缺水程度的测定（脯氨酸法） 45生物化学实验部分实验一 氨基酸的纸层析一、目的：层析分析法已广泛用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类的分离与分析。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质；设备简单，操作容易，样品用量很少，结果也较明确。本实验的目的在于要求学生掌握纸层析法的一般原理和操作技术。二、原理：纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析

3、法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。通常用表示分配系数。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维素对水有较强的亲和力（纸上有很多-OH 基与水以氢键相连），吸附很多水分子，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这一部分水扩散作用降低形成静止相；而有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移

4、动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量也就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在静止相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。移动速度一般用移动速率表示Rf 表示：各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。Rf值决定于很多的因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的

5、分配系数是由以下因素决定的：（1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸分配在水相中，Rf值较小，而含非极性（如-CH3 ）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。（2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。（3）溶剂的纯度、pH值和含水量。pH值和含水量的改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。（4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短

6、，测Rf值的因素必须严格控制。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：在25温箱中萌发2-3天的绿豆芽。2、仪器：（1）恒温水浴一台；（2）烘箱一个；（3）研钵一个；（4）三角瓶一个 ；（5）蒸发皿一个；（6）50毫升分液漏斗一个；（7）量筒三个；（8） 微量吸管（或标有刻度的毛细管）；（9）电热吹风机一个；（10） 层析缸及培养皿；（11）层析滤纸；（12）小型喷雾器一个；（13）剪刀、刀片、铅笔、尺子、玻棒、凡士林、点样瓶。3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：浓度为0.01M，溶于10%异丙醇中。第一组：天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸。第二组：鸟氨酸、甘氨酸、-氨基丁酸、缬

7、氨酸。第三组：谷氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸。第四组：酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺。第五组：胱氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、瓜氨酸、天门冬酰胺。（2）溶液系统：第一向：正丁醇：甲酸：水：（15：3：2，体积），摇匀静止备用。第二向：苯酚：水（80：20，重量）。配制方法：在分液漏斗中先计量加入少量无离子水，再加入一定量的新蒸馏的酚。根据酚量补足应加入的全部无离子水，这样可避免因酚的冷凝而造成的溶解困难。充分摇匀后静止备用。（3）无离子水：用于实验中各种试剂配制。（4）10%异丙醇：用于配制氨基酸标准液。（5）80%乙醇：取分析乙醇以无离子水稀释。（6）0.25%的水合茚三酮溶液。（

8、7）活性炭。（8）石英砂。四、操作步骤：1、氨基酸的提取：取新鲜的绿豆芽下胚轴2克，加80%乙醇10毫升，加少量石英砂，在研钵研成匀浆，移入三角瓶，用少量80%乙醇淋洗研钵，一并移入三角瓶，加0.8克活性炭，置沸水浴中加热至沸1分钟，取下冷却，用滤纸过滤，用少量80%乙醇冲洗滤渣。滤液收集在蒸发皿中置50-60水浴上蒸干。用1毫升10%异丙醇溶解，收集样液，准备点样。2、滤纸的准备：单向层析滤纸：取2828厘米层析滤纸一张，在对应的两边距每边2厘米处，用铅笔和直尺各划一条平行于纸边的直线，其中一条为溶剂前沿到达标志，另一条为点样线。在点样线上每隔2厘米划一与点样线垂直的短线，标出五组标准氨基酸

9、和样品的点样位置双向层析滤纸：取2828厘米层析滤纸二张，在距每边2厘米处各划一条平行于纸边的直线，以“井”字格下边缘直线左端交点为点样原点，原点右手为第一向，另一垂直方向为第二向。用一张作标准氨基酸图谱，另一张作样品图谱。3、点样：点样时选用微量吸管或标有刻度的毛细管（每小格1微升），分别在每个点样处精确点样4微升。必须在每一滴样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可在有加热装置的点样台上进行，或用吹风机吹干，样点的直径以2-3毫米为宜，点样时温度不能过高，否则会破毁氨基酸。将点好样品的单向和双向层析滤纸均卷成筒形，在上、中、下三处系三道线，但滤纸两边缘不能接触。为了消除盐酸的干扰，避免拖尾

10、现象，可将层析滤纸放入盛有浓氨水的层析缸中熏10分钟，取出后在45烘箱中将氨驱净，再行层析。4、层析：本试验采用上层析法。（1）单向层析：取适当大小的层析缸一个，缸底放一培养皿，向培养皿内加入第一向溶剂，液层厚约1.5厘米，在培养皿上横放两根玻棒，取已点好的样品的单向层析滤纸以点样端朝下放在盛有层析溶剂的层析缸内的玻棒上，盖上盖子（滤纸切勿与溶剂接触）。平衡一小时，然后将滤纸放入层析溶剂中，注意样点不能进入溶剂，以免浸脱。将层析缸密封，这时溶剂沿纸上升，待溶剂前沿到达标志线时，立即取出，用吹风机吹干或45下烘干，然后显色。（2）双向层析：按上述单向层析方法，将点好标准氨基酸的样品的双向层析滤纸

11、分别用第一向溶剂进行上行层析，到达前沿标志线时，立即取出吹干溶剂，减去溶剂前沿以外的部分，然后将纸转90角，以同样的方法用第二向溶剂进行上行层析，当溶剂前沿到达标志时立即取出吹干或45下烘干，进行显色。5、显色：用喷雾器将0.25% 的茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，注意不要喷得过多。用吹风机吹干溶剂后，放在60-65烘箱中烘30分钟或用吹风机吹热风，即能显现各种氨基酸的色斑。为了消除铵离子的影响，可在展开后在滤纸上喷1%的氢氧化钾的无水乙醇溶液，在60下保持15分钟，以使全部氨完全挥发掉，再行显色。五、结果与计算：单向层析：显色完毕后，用铅笔将各色谱的轮廓和中心点描绘出来，然后量出由原点至色

12、谱中心点和溶剂前沿的距离，计算出各种已知和未知的色谱的Rf值进行比较和鉴定。各组已知氨基酸色谱顺序由指导教师供给。双向层析：Rf值有两个数值组成，即要在第一向和第二向层析中各计算一次，根据Rf并借助各种氨基酸的特有颜色，分别与标准氨基酸对比，即可鉴定为何种氨基酸。六、附注：色素含量不高的植物样品，可不用活性炭处理。实验二 蛋白质含量测定（设计性实验）一、实验目的我们将逐步改变实验教学都由实验技术人员准备实验，教师讲解，学生照做的方法，尽量多给学生留下思考的时间和创新的机会。在教师指导下，查文献、拟定实验方案、调试仪器、配制药品、处理数据、研究和解决实验中出现的问题，从失败中获得经验，从成功中获

13、得动力。蛋白质含量是农产品品质的重要指标之一，大豆、水稻等农作物是农业院校学生学习研究的最重要的生物材料。农作物品种及各个发育时期或不同栽培条件下的生理生化指标反映了其品种特性和生长的变化规律，掌握这些生理生化指标测定的方法对学生今后的科研实践是非常必要的。在以往的实验中，我们没有开设这样的实验设计项目，使学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位认识不够。所以为了将基础知识与专业技术更好地衔接，使学生将生化基本实验技能应用于农学专业的科研、管理，很有必要开设此项实验。1.本实验通过比较不同大豆(或水稻等)品种或同一品种各个发育时期或不同栽培条件下的籽粒蛋白质含量变化，来掌握测定原理，学习

14、测定方法，并通过分析得出相应结论。2.提高学生对生物化学实验技术在农业研究方向的重要地位的认识；使学生将生化基本实验技能应用于农学专业的未来科研工作中。二、实验室具备的仪器设备及化学试剂等方面的条件1.仪器：电子天平、过滤装置、移液管、滴定装置、可见分光光度计、紫外分光光度计、离心机、水浴锅、温度计、烘箱、真空抽气机、粉碎机、电炉子、实验室常用玻璃器皿；2.试剂：常规化学、生物化学试验的试剂均有，如有特殊要求请说明；3.实验材料：大豆粉、小麦、玉米等。三、整体要求1. 要求学生认真查文献、拟定实验方案、调试仪器、配制药品、处理数据、尽量独立解决实验中出现的问题，必要时与老师商量解决，以达到锻炼

15、提高的目的。2.书写报告要认真、层次清楚、整洁、对结果有客观分析。3.最后要有总结（自我评价），包括独立完成实验的收获、教训、注意事项、实验过程中遇到的问题及解决的方法等。实验三 酶的基本性质酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，因此，也叫生物催化剂。生物体内存在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能够迅速完成复杂的代谢过程。所以了解酶的基本性质，对于揭示各种生化进程具有非常重要的意义。酶的高效性一、目的：通过本实验认识酶的催化效率比一般催化剂高。二、原理：酶作为一种特殊的催化剂，能大大降低反应的活化能，从而极大地加快了反应速度。这在生理上具有极其重要的意义。在生物体内，某些代谢由于需氧脱氢的

16、结果而产生对机体有毒害作用的H2O2。过氧化氢酶能催化过氧化氢很快地分解成H2O和O2，使H2O2不致在体内大量积累。铁粉也是过氧化氢分解的催化剂，但其催化效率仅为过氧化氢酶的100亿分之一。三、实验材料、仪器和试剂：1实验材料：马铃薯2仪器：（1）试管：4支；（2）管架：1个；（3）研钵；（4）量筒：10毫升13试剂：（1）2% H2O2；（2）铁粉四、操作步骤管号项目12342%H2O2（ml）3333生马铃薯糜少许熟马铃薯糜少许铁 粉少许现 象解释现象取4支试管，编号，按上表操作。酶的特异性（专一性）一、目的1. 了解酶的特异性。2. 掌握检查酶的特异性的方法及其原理。二、原理：酶与一般

17、催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异性，即一种酶只能对一种或一类化合物起催化作用。例如：蔗糖酶只能催化蔗糖的水解，而不能催化淀粉的水解；而淀粉酶能催化淀粉水解，却不能催化蔗糖水解。本实验以蔗糖酶和淀粉酶对蔗糖和淀粉的作用为例来说明酶的特异性。三、仪器和试剂：1仪器：（1）研钵 ；（2）试管：6 支；（3）试管架；（4）小烧杯；（5）刻度吸管：1毫升5，2毫升1 ；（6）漏斗；（7）电热恒温水浴。2试剂：（1）1% 淀粉溶液（含0.3%NaCl）：将1克可溶性淀粉及0.3克氯化钠，混悬于5毫升蒸馏水中，搅动后缓慢倒入沸腾的60毫升蒸馏水中，搅动煮沸1分钟。晾至室温后加水至100毫升，放置于冰

18、箱贮存。（2）2% 蔗糖溶液：蔗糖是典型的非还原糖，若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准，则呈还原性，这种蔗糖不能使用。所以，实验前必须进行检查。本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂，要现用现配。（3）淀粉酶液：稀释200倍的新鲜唾液。（4）蔗糖酶液：取1克新鲜酵母放入研钵中，加少量石英砂和蒸馏水，研磨10分钟左右，用蒸馏水稀释至50毫升，静止片刻再过滤，滤液即为蔗糖酶提取液。（5）本乃狄（Benedict）试剂：将17.3克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中。冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克及碳酸钠（Na2CO3H2O）100克，加水600毫升，加热使之溶解，冷却后，稀释至850毫升。最后

19、把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此试剂可长期保存。四、操作步骤：取6支试管编号，按下表操作： 编号操作项目1234561%淀粉（ml）1112%蔗糖（ml）111淀粉酶液（ml）11蔗糖酶液（ml）11蒸馏水（ml）11反应摇匀，放入37水浴中保温10分钟木乃狄试剂（ml）222222反应摇匀，放入沸水加热数分钟结果解释实验现象温度对酶活力的影响一、目的：通过检验不同温度下淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响，并进一步明确酶的最适温度的概念。二、原理：酶的催化作用受温度的影响很大。在一定温度范围内，随着温度的升高，酶的热变性不显著，而酶促反应速度增加，直至

20、达到最大值。由于酶是一种蛋白质，温度过高会引起酶的急剧变性，导致酶失活，因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度急剧下降，以至完全停止酶促反应。反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为3740，植物酶的最适温度为5060。本实验以不同温度条件下淀粉酶作用于淀粉，并用碘液检查酶促淀粉水解程度，来说明温度与酶活力的关系。三、仪器和试剂：1仪器：（1）刻度吸管：1毫升2，2毫升1；（2）试管：3支；（3）试管架；（4）恒温水浴：3个；（5）冰浴2试剂：（1）1%淀粉溶液（含0.3%NaCl）：配法如前。（2）pH7.0磷酸盐缓冲液：配法同前。（3）碘液四

21、、操作步骤：取3支试管，按下表操作：项目管号淀粉酶液（ml）酶液处理5分钟pH6.8缓冲液（ml）1淀粉液（ml）反应条件10分钟冷却3分钟碘液（滴）结果110210流动水冷却1213721371317021701解释实验现象。酶的激活和抑制一、目的：了解酶促反应的激活和抑制作用；学习激活剂和抑制剂影响酶促反应的方法和原理。二、原理：酶的活力常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活力增加，称为激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为抑制剂。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化纳达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活力。

22、三、仪器和试剂：1仪器：（1）试管：3支；（2）试管架；（3）漏斗；（4）烧杯；（5）刻度吸管：1毫升4，5毫升1；（6）恒温水浴；（7）10毫升1四、操作步骤：取3支试管，按下表操作 管 号项 目1231%NaCl（ml）1蒸馏水（ml）11%CuSO4（ml）1唾液淀粉酶（ml）111将上述各管试剂混匀0.1淀粉（ml）333保温反应检验淀粉水解程度摇匀后放入37水浴中保温反应1分钟左右，从1号试管取出1滴溶液置白瓷板上，用碘液检查淀粉的水解程度，待试液不再变色时，取出所有试管。现象解释现象实验四 维生素C含量的测定一、目的：维生素C是人类营养中最重要维生素之一，缺乏时会产生坏血病。水果、

23、蔬菜是供给人类维生素C的主要来源。通过对维生素C含量的测定，可以了解果品质量的高低，并掌握这一测定方法。二、原理：利用染料2,6-二氯酚靛酚作氧化剂，可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身被还原成无色的衍生物。2,6-二氯酚淀粉在酸性条件下呈红色。在滴定终点之前，滴下的2，6-二氯酚淀粉立即被还原成无色。当溶液从无色转变成为红色时，即为滴定终点。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：水果或蔬菜。2、仪器：（1）微量滴定管；500毫升1；（2）量瓶：50毫升2；（3）三角瓶；500毫升2；（4）研钵；（5）量筒； （6）刻度吸管；10毫升2；3、试剂：（1）1%草酸：秤取5.0克草

24、酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升。（2）2%草酸：秤取10.0克草酸溶于少量蒸馏水中，定容至500毫升。（3）0.001N 2，6-二氯酚靛酚钠溶液：称取干燥的2，6-二氯酚靛酚钠60毫克，放入200毫升量瓶中，加热蒸馏水中100-150毫升，滴加0.01N NaOH4-5滴，强烈摇动10分钟冷却后加水至刻度。摇匀后用紧密滤纸滤于棕色瓶中，贮于冰箱中备用，有效期一周。使用前需标定（见附注）。四、操作步骤：1、样品的处理和提取：称取4.0克新鲜样品，至研钵中，加5毫升2%草酸，研成匀浆。通过漏斗将样品提取液转移到50毫升量瓶中。残渣再用2%草酸提取2-3次，提取液及残渣一并转入量瓶。2%草酸

25、总量为35毫升，最后以水定容。溶液定容时若泡沫较多，可加几滴乙醇消除泡沫后再定容。摇匀，过滤，滤液备用。2、样品的测定：吸取滤液10毫升，放入50毫升三角瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现明显的红色，并在15秒内不消失为止。记录所用滴定液体积。3、空白测定：在另一50毫升三角瓶内，放入35毫升2%草酸，并用1%草酸定溶，摇匀，取此液10毫升放入另一50毫升三角瓶内，用2,6-二氯酚靛酚钠滴定至终点，记录染料用量。结果与计算：X：100克样品所含维生素C毫克数（毫克/100克）W：称取样品重（克）V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V：样品提取液稀释之总体积（即5

26、0毫升）K：1毫升染料液所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出六、附注：（1）2,6-二氯酚靛酚钠溶液的标定：准确称取维生素C20毫克，用1%草酸溶解定容至200毫升。吸取此液10毫升，以1%草酸再次稀释定容至200毫升。吸取此液10毫升，放入50毫升三角瓶中（同时吸取10毫升1%草酸于另一个50毫升三角瓶中，做空白对照立即用所要标定的2，6-二氯酚靛酚钠滴定至粉红色出现15秒不消失，记录所用毫升数，按下式计算K值（即1毫升染料所能氧化抗坏血酸的毫克数）。(式中：G为称取维生素C的毫克数。V为滴定10毫升标准维生素C时所用去染料的毫升数，与滴定空白所用毫升数之差值)（2）操作要尽可能快，并防止

27、与铁铜器具接触，以减少维生素C的氧化。（3）草酸及样品的提取液避免日光直射。（4）当样液本身带色时，测定前于提取液中加2-3毫升二氯乙烷。在滴定过程中当二氯乙烷由无色变粉红色时，即达终点。实验五 还原糖和总糖的测定一、目的：掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉721型分光光度计的使用方法。二、原理：各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖将3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被

28、氧化成糖酸及其它产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅的程度呈一定的比例关系，在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9 即为实际的总糖量。三、实验材料、仪器和试剂1、实验材料：面粉。2、仪器： (1) 25ml 血糖管或刻度试管11；(2) 大离心管或玻璃漏斗2；(3) 烧杯：100ml1；(4) 三角瓶：100ml1；(5) 容量瓶：100ml3；(6) 刻度吸管：1ml11、2ml4、10ml1；(7) 恒温水浴；(8) 沸水

29、浴；(9) 离心机(过滤法不用此设备)；(10)电子天平；(11)分光光度计；3、试剂：(1) 1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取 100 mg分析纯葡萄糖(预先在 80 烘至衡重)，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。(2) 3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2NNaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。(3) 碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml

30、蒸馏水中。(4) 酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。(5) 6NHCl(6) 6NNaOH四、操作步骤1、制作葡萄糖标准曲线：取7支具有25ml刻度的血糖管或试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。数量 管号项目0123456葡萄糖标准溶液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水杨酸试剂（ml）1.51.51.51.51.51.51.5将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻

31、度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1-6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。2、样品中还原糖和总糖的测定：（1）样品中还原糖的提取：准确称取2g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量的蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。(2)样品中非还原糖的水解和提取：准确称取1

32、g食用面粉，放在100ml 的三角瓶中，加入10 ml 6NHCl及15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30分钟。取12 滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入一滴酚酞指示剂，以6NNaOH中和至微红，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml定容过的水解液，移至另一100ml的容量瓶中，定容，混匀，作为总糖待测液。(3)显色和比色：取5支25ml刻度的血糖或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂。数量 管号项目还原糖测定管号

33、总糖测定管号还原糖待测液（ml）22000总糖待测液（ml）00110蒸馏水（ml）001123,5-二硝基水杨酸试剂（ml）1.51.51.51.51.5加完试剂后，其余操作均与葡萄糖标准曲线是相同，测定各管消光值。五、结果与计算：以管、的消光值平均值和管、的消光值的平均值，分别在标准曲线查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。六、附注：1、用血糖管比大试管方便。2、离心比过滤易得清液。3、标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。实验六 淀粉酶活性的测定一、目的：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的

34、淀粉酶活性最强。植物中有-淀粉酶及-淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。本实验的目的在于掌握分别测定这两种淀粉酶的方法。二、原理：-淀粉酶及-淀粉酶，各有其一定的特性，如-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化而-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化，通常提取液同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70维持15分钟以钝化-淀粉酶，便可测定-淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0加以处理，钝化-淀粉酶的活性，以测出-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5-二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后

35、者还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的深度成正比，故可求出麦芽糖的含量，以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。三、实验材料仪器及试剂：1、实验材料：萌发的小麦（芽长1厘米左右）2、仪器：（1）小台秤；（2）研钵；（3）容量瓶：100毫升1；（4）具塞刻度试管25毫升13；（5） 试管：8支；（6）刻度吸管：1毫升2，2毫升2；（7）离心机；（8） 恒温水浴； （9）分光光度计。3、试剂：（1）1%淀粉溶液；（2）0.4 N NaOH；（3）pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01克，溶解后稀释至1升；B、称取柠檬酸钠29.41克，溶解后稀释至1升

36、。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀，即为pH5.6之缓冲液。（4）3,5-二硝基水杨酸：精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中，加入50毫升蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100毫升，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。（5）麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中，仔细移入100毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。四、操作步骤：1、酶液的提取：称取2克萌发的小麦种子（芽长1厘米左右），至研钵中加一克石英砂，磨成匀浆倒入25毫升具塞刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀后在室温（20）下放置，每隔数分钟震荡一次，放置15-20分钟，离心，取上清

37、液备用。2、-淀粉酶活性的测定：（1）取试管4支，注明两支为测定管。（2）于每管中各加酶提取液1毫升，在70恒温水浴中（水温度的变化不应超过0.5）准确加热15分钟，在此期间-淀粉酶受热而钝化，取出后迅速在自来水中冷却。（3）在试管中各加入1毫升pH5.6柠檬酸缓冲液。（4）向对照管中加入4毫升0.4N氢氧化钠，以钝化酶的活性。（5）将测定管和对照管置40（0.5）恒温水浴中保温15分钟，再向各管分别加入40下预热的淀粉溶液2毫升，摇匀，立即放入40水浴中准确保温5分钟后取出，向各测定管迅速加入4毫升0.4N氢氧化钠，以终止酶的活动，然后准备下步糖的测定。3、-淀粉酶及-淀粉酶总活性的测定：取

38、上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸馏水稀释至100毫升（稀释程度视酶活性大小而定）混合均匀后，取4支试管，各加入稀释之酶液1毫升及1毫升pH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。4、麦芽糖的测定：（1）取25毫升刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（2）样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液

39、各2毫升，分别放入25毫升具塞刻度试管中，再加入2毫升3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀，置沸水中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25毫升，混匀。用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，然后进行结果计算。五、结果计算： A -淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（在标准曲线上查得值）A -淀粉酶的对照管中麦芽糖量B （+）- 淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量B （+）- 淀粉酶的对照管中麦芽糖量C 比色时所用样品液毫升数实验七 脂肪浸提索氏脂肪浸提法一、目的：学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。二、原理：用脂肪溶剂将脂肪从样品中浸提出来，然后将溶剂蒸发

40、除去，称取瓶中残留物的重量或称量样品损失的重量，即可求出样品中粗脂肪的含量。在测定样品含油量时，通常采用沸点低于60的有机溶剂作为脂肪溶剂 (如乙醚和沸点为30至60的石油醚)所提取的脂溶性物质为脂类物质的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，因此称为粗脂肪。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：（1）待测植物样品；（2）滤纸筒。2、仪 器：（1）兰氏脂肪浸提仪；（2）电热恒温水浴；（3）分析天平。3、试 剂：（1）乙醚。四、操作步骤：1、仪器的安装：将索氏脂肪浸提取仪的冷凝管及脂肪接受瓶的磨砂玻璃接口处用铅笔编号，洗净烘干。脂肪接受瓶放入干燥器内冷却

41、后称取空瓶质量，仍放回干燥器内备用。将冷凝器用铁驾台卡夹安装在加热用的电热恒温水浴上，装牢。在冷凝器的进出水口分别装上橡胶管，通向冷凝器内蛇型管的短管为进水口，通向外层的短管为出水口。2、样品的称取：取滤纸筒（2570毫米）截成35毫米的长度，用铅笔编号，两边对称的夹上一个回形针，留出一段铁环作挂钩用。在分析天平上称取空滤纸筒的重量，加入经 1 毫米筛孔制备的样品2 3克，称准其重量，再向滤纸筒塞入脱脂棉一小块，防止样品散失，将已加入样品的滤纸筒放在一个小烧杯内，然后放入90的真空干燥烘箱内烘56 小时，取出放入干燥器内冷却备用。3、脂肪的浸提：将滤纸筒挂在冷凝器内固定在杆下端的钩子上，再将脂

42、肪瓶加入无水乙醚70毫升，套在冷凝器下面的磨口上。把装好冷凝器的脂肪瓶放在预先调好温度（50-60）的电热水浴上。松开固定杆上的止水夹，将滤纸筒浸入乙醚内，开放冷凝水阀门，注意乙醚煮沸的情况，要求回流速度适当，不可太快，以免冷凝不及乙醚在冷凝器上部逸失。滤纸筒内样品经热沸的乙醚浸提20分钟后，提起滤纸筒操作杆至最高位置，冷凝后的乙醚自溢流管流入，装满滤纸筒，使之淋洗滤纸筒上部的筒壁，然后从乙醚逐步回收管回收乙醚，直至脂肪接受瓶中的乙醚完全蒸发干为止。关闭电源，关上冷凝水的阀门。4、脂肪瓶的干燥和滤纸筒乙醚的回收：脱下脂肪瓶，用绸布擦去手摸的痕迹及沾上的尘土，放入90的直空干燥箱内烘45-60分

43、钟后取出放入干燥器内，冷却半个小时后称重。滤纸筒脱离挂钩后立即放入一个空的脂肪瓶内，一个脂肪瓶可以同时放入4-8个，套上冷却器，开放冷却水，打开水浴电源回收乙醚。五、计算结果：六、附注：乙醚易燃，操作时应特别注意，加乙醚时不要打开电门，脂肪瓶与冷凝器的结合必须吻合，不能漏气，脂肪浸提仪附近不能有明火闪动。乙醚试剂瓶应远离加热器。实验八 一种简单实用的提取植物DNA的方法一、目的与原理：植物DNA的提取是植物分子生物学和基因工程研究的一种基本的技术，至今已有了数种方法。此方法最大的特点是：将SDS同时用作细胞膜的去污剂和蛋白质的变性剂，变性的蛋白质通过离心而不是酚抽提除去，使得整个操作过程变得简

44、单快捷，比较温和，1小时左右就可以获得纯化的植物DNA。用这种方法得到的DNA能直接被限制性内切酶酶解，纯度较高，适用于分子生物学的研究。本实验的目的是掌握DNA提取的原理和方法。二、材料与方法：1、植物材料：螺旋藻（Spirulina platensis）、水稻（Oryza sativa）和烟草（Nicotianatabacum）.2、试剂和溶液：（1）20SSC：3molL-1柠檬酸钠，pH8.0：（2）溶菌酶、10gl-1Rnase、10%SDS（均为Sigma产品）；（3）酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（4）TE：10mmolL-1Tris-HCL、1mmolL-1EDTA，pH7.

45、6。3、提取步骤：收集对数生长期的螺旋藻细胞，悬浮于5倍体积（v/w）含2mgmL-1溶菌酶的20SSC中，室温保持10分钟，偶尔摇动混匀。水稻幼苗和烟草嫩叶在液氮中研磨成粉状后，立即用5倍体积的20SSC悬浮，并轻轻拌匀。上述悬浮液在冰上先放置3分钟，然后加入10% SDS至终浓度为2%，混匀；继续放置10分钟后，在4用11000g离心15分钟。上清液转移至新的离心管中，并用相同体积的TE稀释，再加入RNase至终浓度为10gml-1，室温放置30分钟。11000g离心15分钟，所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗两次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于适量的TE中。三、结果与讨论：利用本方法，从

46、烟草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因为整个过程的操作步骤较少，也较温和，减少了DNA被弄断的机会，所以所得的DNA分子量较大，大部分都比完整的噬菌体的DNA（48.5Kb）还大。另外，用此方法所提的DNA的OD260/OD280的比值1.8至1.9之间，并能被限制性内切酶酶切，显示有较好的纯度。在使用本方法时，须注意下面的几个问题。当20SSC的悬浮液中加入SDS至2%后，溶液中会出现白色絮状物质，表明蛋白质已经变性，这是本方法的主要特点之一。它通过变性后离心而不是常用的多次酚抽方法，将绝大部分的蛋白质除去。离心所得的上清液，需要用TE稀释，这是因为溶液中的盐浓度较高，如不稀释，RNase就无

47、法起作用；而且在沉淀DNA时，如用乙醇会将溶液中的盐析出，如用异戊醇则形成两相的界面，将溶液中盐的浓度降低后，就解决了这些问题。但是，加大稀释TE的体积，对于DNA的产量并无非常明显的作用，用等体积的TE稀释即可。DNA抽提液经RNase酶解后，再用酚：氯仿：异戊醇抽提一次，用以除去剩余的蛋白质和酶。本方法适用于大量和微量的DNA制备。大量制备时，RNase酶解和酚：氯仿：异戊醇的抽提步骤可以在DNA浓缩一些后再使用，这样就较便于操作，并且节省RNase和酚。通常，用这种方法能从每克新鲜组织中提取到10至15g的DNA。实验九 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定大麦、小麦种子纯度一、目的：本实验采用聚丙

48、烯酰胺凝胶电泳技术，提取分离种子中的蛋白质，根据不同品种的蛋白质谱带与标准谱带的差异，可鉴定出品种的真实性和纯度。本实验目的是掌握聚丙烯酰胺电泳的原理、实验方法以及此方法在种子鉴定中的应用。二、原理：从种子中提取的醇溶蛋白在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下得到良好的分离，通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传组成不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品种真实性和纯度进行鉴定。三、仪器和试剂：1、仪器：电泳仪（满足稳压500V）、离心机、垂直板电泳槽、钳子、5ml、10ml移液管、微量进样器、聚丙烯离心管。2、试剂：尿素，乙醇，甘氨酸，甲基绿，

49、三氯乙酸，冰乙酸，过氧化氢，硫酸亚铁，抗坏血酸，-氯乙醇。3、药剂配制：（1）蛋白质提取液：小麦：0.05克甲基绿溶于25毫升-氯乙醇中，加蒸溜水至100毫升。低温保存。大麦：0.05克甲基绿溶于20毫升-氯乙醇中，加入118克尿素，再加入1毫升-巯基乙醇，加蒸溜水至100毫升。低温保存。（2）电泳缓冲液：0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解，加4毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低温保存。（3）凝胶缓冲液：1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解，加20毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低温保存。（4）0.6%过氧化氢：30%过氧化氢2毫升，加蒸溜水至100毫升。低温保存。（5）染色液：0.25克考马斯亮蓝加25毫升无

50、水乙醇溶解，加入50克三氯乙酸，加水至500毫升。（6）凝胶液：丙烯酰胺20克，甲叉双丙烯酰胺0.8克，尿素12克，硫酸亚铁0.01克，抗坏血酸0.2克，用凝胶缓冲液溶解并定容至200毫升。低温保存。四、实验步骤：1、样品提取：一般每个样品测定100粒种子，若更准确地估测品种纯度，则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度的标准值比较，可采用顺次测定法（sepuential testing）来确定，即50粒作为一组，必要时刻连续测定数组，以减少工作量。如果只鉴定真实性，可用50粒。取小麦或大麦种子，用钳子逐粒夹碎（夹种子时最好垫上小片清洁的纸，以便于清理钳头和防止样品之间的污染），置1.5毫升离

51、心管中，加入蛋白质提取液（小麦0.2毫升，大麦0.3毫升）充分摇动混合，在室温下提取24小时，然后在18000g条件下离心15分钟。取其上清液用于电泳。2、凝胶制备：从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢液，吸取10毫升凝胶溶液，加1滴0.6%过氧化氢，摇匀后迅速倒入封口处，稍加摇动，使整条缝口充满胶液，让其在5-10分钟聚合封好。吸取45毫升凝胶溶液，加3滴0.6%过氧化氢，迅速摇匀，倒入凝胶板之间，马上插好样品梳，让其在5-10分钟内聚合。3、进样：小心抽出样品梳，将玻璃板加在电泳槽上，用滤纸或注射器吸取样品槽中多余的水分，然后用微量进样器吸取10-20l样品加入样品槽中。4、电泳：在前后槽注入电

52、极液，前槽接正极，后槽接负极。然后打开电源，逐渐将电压增到500V电泳时，要求在15-20温度下进行。电泳时间一般为60-80分钟，具体时间可按甲基绿迁移时间来推算，电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。5、染色：将胶板小心的取下，在染色液中染色1-2天。一般情况不需要脱色，但为使谱带清晰，可用清水冲洗。五、鉴定：谱带命名可采用相对迁移率法，或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性，并与标准样品电泳图谱比较，坚定种子真实性以及测定品种纯度。实验十 淀粉酶的诱导、提取和活性测定（综合性实验）一、实验原理大麦（或小麦）种子萌发时，种胚产生GA3扩散到胚乳的糊粉层细胞（被称为GA

53、3反应的“靶细胞”），刺激其合成或激活-淀粉酶，然后进入胚乳，使贮藏的淀粉被水解为还原酶，因此，无胚种子不能释放GA3，也不能形成与激活-淀粉酶。外加的GA3也可代替胚的释放作用，从而诱导-淀粉酶的合成。在一定范围内，由去胚的吸胀大麦产生的还原糖量，与外加GA3浓度的对数成正比，由此可说明GA3对-淀粉酶的诱导形成。二、材料与用品1、材料：大麦（或小麦）种子；2、仪器：721分光光度计；超净工作台（或灭菌箱）；温箱；摇床；恒温水浴；高压灭菌锅；棉塞；牛皮纸；刀片；镊子；烧杯；培养皿；试管；移液管；玻璃棒。3、药品：10-3mol/L乙酸缓冲液（pH 4.8）每ml含链霉素硫酸盐1mg（或氯霉素40g）、10 mg/L GA310 mg，加少量95%乙醇溶解，用蒸馏水定容至1000ml、淀粉溶液（称取可溶性淀粉0.67g和KH2PO40.82g溶于20 ml蒸馏水中不断搅拌下加到70ml沸水中，最后加水定容至100ml）、I2- KI溶液（称取I2 0.06g和KI 0.6g，溶于0.05mol/L HCL溶液1000ml中）、5%漂白粉溶液（W/V）、5% H2SO4溶液（W/V）、灭菌水、石英砂。三、方法与步骤1、材料准备选择对GA3敏感、萌发高、大小一致的小麦种子，用50% H2SO