药学第15章转录与基因表达调控.ppt

1、2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,转录与基因表达调控 Transcription and gene expression & regulation,第 十五 章,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,复制和转录的区别,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿

2、,第一节 RNA的生物合成（转录）,（一） 转录模板 （二）RNA聚合酶 （三）酶与模板辨认结合 （四） 原核生物转录过程 （五）真核生物转录过程 （六） 真核生物转录后的修饰 （七）RNA的复制,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,（一）转录模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,5

3、GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,5 3,3 5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,（二）RNA聚合酶,1、原核生物的RNA聚合酶,20

4、08年5月 药学类专业生物化学讲稿,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2、真核生物的RNA聚合酶,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,（三）模板上酶的辨认、结合,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,RNA聚合酶保护法,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,开始转录,T T G A C

5、 A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点 (recognition site),2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,1、转录起始,转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,（四）原核生物的转录过程, DNA双链解开, RNA聚合酶全酶(2)与模板结合, 在RN

6、A聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2、转录延长, 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；, 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,目 录,2008年5月

7、药学类专业生物化学讲稿,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,依赖Rho ()因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,3、转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,A T P,依赖 Rho因子的转录终止,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,5

8、UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,茎

9、环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,（五）真核生物的转录起始,1、转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element), 转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2008年5月 药学

10、类专业生物化学讲稿, 转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,参与RNA-pol转录的TF,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿, 转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,TFF,A,

11、B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿, 模板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2、转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录

12、延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,3、转录终止, 和转录后修饰密切相关。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,几种主要的修饰方式, 剪接(splicing), 剪切(cleavage), 修饰(modification), 添加(

13、addition),（六）真核生物的转录后修饰,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,1、真核生物mRNA的转录后加工,加帽子,5端形成 帽子结构(m7GpppGp ),2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,帽子结构,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,5 pppGp,帽子结构的生成,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,3端加上多聚腺苷酸尾巴(poly A tail),加尾巴,但多聚A尾形成并不是简单地加入A,而是 先要在mRNA前体的3末端切除一些多余的附加核苷酸,然后再加入多聚A。在mRNA前体3末端11-30核苷酸处有一段AAUAA保守序列,在U7-snRNP的协助下识别,由

14、一种特异的核酸内切酶催化切除多余的核苷酸。随后,在多聚A聚合酶催化下,发生聚合反应形成了3末端多聚A尾。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,mRNA的剪接,hnRNA 和 snRNA,核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA),2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene

15、),编码区 A、B、C、D,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,外显子(exon)和内含子(intron),外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：也发现于

16、线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,mRNA的剪接方式, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,snRNP与hnRNA结合成为并接体,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,剪接过程的二次转酯反应,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿, RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。, mRNA的编辑(mR

17、NA editing),6666位CU 结果CAAUAA,2、tRNA的转录后加工,tRNA前体,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,3、rRNA的转录后加工,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,（七）RNA的复制,有些病毒如噬菌体f2、MS2、R17和Q等均具有RNA基因组。这些RNA病毒的染色体为单链RNA,在病毒蛋白质的合成中具有mRNA的功能。病毒RNA进入宿主细胞后,还可进行复制,即在RNA指导的RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase, RDRP) 或称RNA复制酶(RNA replicas

18、e)催化下进行RNA合成反应。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,RNA复制酶分子量约为210000,由四个亚基组成。其中只有一个分子量为65000亚基,是病毒RNA复制酶基因的产物,其结构中具有复制酶的活性部位。其它的三个亚基全是宿主细胞中正常合成的蛋白质。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,RNA复制酶还需要有宿主细胞中的三种蛋白质因子协助其发挥作用。它们是延长因子TU(分子量30000)和Ts(分子量45000),以及S1(分子量70000)。这些因子可以帮助RNA复制酶定位并结合于病毒的RNA3末端,引发RNA的复制。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,RNA复制酶催

19、化的合成反应是以RNA为模板,由53方向进行RNA链的合成。反应机理与其他核酸模板指导的核酸合成反应相似。RNA复制酶缺乏校对功能的内切酶活性,因此RNA复制的错误率较高,这与DNA指导的RNA聚合反应情况是相类似的。RNA复制酶只是特异地对病毒的RNA起作用,而宿主细胞RNA一般并不进行复制。这就可以解释在宿主细胞中虽含有数种类型的RNA,但病毒RNA是优先进行复制的。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,1、基因表达的概念 本世纪50年代末，生物科学家们揭示了生物遗传信息从DNA传递到蛋白质的规律中心法则。那么，究竟是什么机制控制着遗传信息的传递规律呢？一个基因究竟应该在什么时候、什么

20、组织器官开启或关闭的？1961年，Francis Jacob和Jacques Monod通过E.coli基因表达调控研究提出了著名的操纵子（元）学说，开创了基因表达调控研究的新领域。 基因表达调控是分子生物学及分子遗传学发展的新领域，涉及很多基本概念和原理，这是认识原核、真核基因表达调控的基础。,第二节 基因转录的调节,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,基因表达就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，赋予细胞或个体一定的功能或形态表型。但并非所有基因表达过程都产生蛋白质。rRNA、tRNA编码基因转录产

21、生RNA的过程也属于基因表达。 无论是病毒、细菌，还是多细胞生物，乃至高等哺乳类动物及人，基因表达表现为严格的规律性，即时间、空间特异性。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,时间特异性 噬菌体、病毒或细菌侵入宿主后，呈现一定的感染阶段。随感染阶段发展、生长环境变化，有些基因开启，有些基因关闭。按功能需要，某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性（temporal specificity）。 空间特异性 在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达多少是不一样的；即使在同一生长阶段，不同的基因表达产物在不同的组织、器官分布也不完全相同。

22、在个体生长、发育全过程，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性（spatial specificity）,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,基因表达的多级调控 。目前已有证据表明，基因结构活化、转录起始、转录后加工及转运、翻译及翻译后加工等均为基因表达调控的控制点。可见，基因表达调控是在多级水平上进行的复杂事件。其中，转录起始是基因表达的基本控制点。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2、原核细胞转录水平的调节操纵子学说 原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子（元）（operon）通常由2个以上的编码序列与启动序

23、列（promoter）、操纵序列（operator）以及其它调节序列在基因组中成簇串联组成。 启动序列是RNA聚合酶结合并起动转录的特异DNA序列。各种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列（consensus sequence）。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,E.coli及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT，又称Pribnow盒（Pribnow box），在-35区域为TTGACA（图）。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起始。 特异DNA序列 原核生物操纵子（o

24、peron） 启动序列 操纵序列 编码序列 调控区,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列与启动序列毗邻或接近，其DNA序列常与启动序列交错、重迭，它是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合有阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异DNA序列可结合激活蛋白，此时RNA聚合酶活性增强，使转录激活，介导正性调节。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类

25、专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,3、真核细胞基因转录的调节 参与真核生物基因转录激活调节的DNA序列比原核更为复杂。绝大多数真核基因调控机制几乎普遍涉及编码基因两侧的DNA序列顺式作用元件，及其与顺式作用元件特异结合的反式作用因子。 顺式作用元件：通过启动子、增强子等DNA元件来控制基因转录的调节方式称为顺式调节，这一类存在于DNA上的特定序列，称为顺式作用元件(cis-acting element)。如TATA盒、CCAAT盒等。这些共有序列就是顺式作用元件的核心序列，它们是真核RNA聚

26、合酶或特异转录因子的结合位点。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,顺式作用元件通常是非编码序列。顺式作用元件并非都位于转录起始点上游（5端）。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子及沉默子等 反式作用因子：与顺式作用元件进行特异性结合的蛋白质因子被称为反式作用因子(trans- acting factor)。因为反式作用因子与顺式作用元件的结合是基因转录水平的调控方式，因而反式作用因子也称为转录因子(transcription factor),2008年5月 药学类专业生物化

27、学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,转录因子的几个家族： 螺旋-转角-螺旋(Helix-turn-helix)蛋白：两个-螺旋由短肽转折形成1200转角，其中一个-螺旋称为“识别螺旋”可以与DNA的大沟相结合。 亮氨酸拉链(Leucine zipper) 锌指结构（Zinc Finger) 上述蛋白质因子都是DNA结合蛋白，通过和DNA的特异结合，对转录起到调控作用。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,锌指（zinc finger）：一个-螺旋和两个反平行-折叠组成。N-端二个Cys、C-端二个H

28、is之间形成的洞穴容纳Zn2+。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,Zn2+可稳定-螺旋，使-螺旋能镶嵌于DNA的大沟中。DNA、RNA结合模序。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,LZ结构与DNA结合。,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,一、逆转录的概念,以RNA为模板，以dNTP为原料，在逆转录酶作用下，合成DNA的过程称为逆转录（ Reverse Transcription ）,第三节 反转录,2008年5月 药学类专业生物化学讲稿,逆转录酶(reverse transcriptase) RDDP 模板：RNA 原料：dNTP 引物：tRNA