db33t 432-2003 畜禽产品质量安全监督抽查检验细则

DB33T4322003畜禽产品质量安全监督抽查检验细则77ICS6502001B00备案号14143A、附录B、附录C、附录D、附录E为规范性附录。本标准由浙江省农产品质量安全监督检测协调会议办公室提出。本标准起草单位浙江省畜产品质量安全检测中心。本标准主要起草人朱聪英、宣士荣、陆春波、周文海、汪刚DB33/T432A中方法1筛选。421筛选结果为阳性的样品按本标准附录A中方法1的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。43土霉素、金霉素、四环素431按本标准附录B的规定筛选。432筛选结果为不合格的样品按GB/T149311的规定重新检验，结果判定以本次检验结果为准。44呋喃唑酮按NY5039A规定检验。45氯霉素451按本标准附录C的规定筛选。452筛选结果为阳性的样品按NY5029A（规范性附录）动物尿样中莱克多巴胺残留量的检测方法方法1酶联免疫色谱法A1原理利用固相酶联免疫吸附原理，加入尿样及酶标莱克多巴胺抗原（已知抗原）与抗体进行免疫竞争反应，未反应的酶标物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶标法来判断。显色的强弱与样品中的莱克多巴胺成反比。A2试剂与材料美国TCC莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品。A3仪器与设备A31微孔板酶标仪450NM。A32振荡器。A33离心机（0RPM10000RPM）。A3420UL,50UL,100UL,A35冰箱（28）。A36洗板机。A4测定步骤A41样品处理用PBS缓冲液以13稀释尿液样品，4000转离心5分钟，取上清液测定。A42使用之前将所有试剂回升至室温2024。A43将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架,标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。A44加入50UL的标准和处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。A45加入100UL第一抗体溶液到每一个微孔中底部，在37孵育30分钟后用工作洗液洗板，最后用洗水纸洗干。A46加入150UL稀释的酶标记的第二抗体37孵育30分钟后用工作洗液洗板，最后用洗水纸洗干。A47加入100UL底物液到微孔中，充分混合并在室温孵育3分钟8分钟。A48加入50UL反应终止液到微孔中，混合好在450NM处测量吸光度值。A5结果计算以0标准吸光度值为100计算，折算出各标准和样品的相对吸光度值。标准的吸光度值或样品相对吸光度值（）X1000标准的吸光度值DB33/T432A6注意事项A61试剂盒应放在28保存。A62为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。方法二气相色谱质谱法测定A7原理动物尿样中总的莱克多巴胺需要通过葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解，本方法仅测定尿样中游离的莱克多巴胺含量。用乙酸乙酯提取后，提取液蒸发至干，用乙酸乙酯溶解后加到SPESLH净化柱上，先用乙酸乙酯溶液洗脱除杂，然后用10乙醇/乙酸乙酯将莱克多巴胺洗脱，洗脱液蒸发至干后，用BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）1TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，然后用GC/MS法测定OHNHOHOH图A1标准莱克多巴胺分子结构式A8试剂莱克多巴胺标准品（纯度大于98）；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水、无水硫酸钠等均为分析纯；BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）、TMCS（三甲基氯硅烷）。CLESLH型SPE净化柱或同等效果的净化柱。莱克多巴胺标准储备溶液（5MG/ML）准确称取50MG莱克多巴胺于10ML容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用。使用时稀释到一定浓度。A9仪器设备色质联用仪；旋转蒸发仪；A10试验方法A101样品处理A1011莱克多巴胺的提取取100ML动物尿样，加10ML乙酸乙酯，振荡萃取，重复2次，有机相过无水硫酸钠在60水浴中真空蒸发，氮气吹干。A1012加40ML乙酸乙酯溶解剩余物，移2ML到CLESLH型SPE净化柱上，然后用10ML乙酸乙酯淋洗除杂，最后用10ML10乙醇/乙酸乙酯（VV）洗脱，洗脱液在水浴中蒸干，氮气吹干。A1013莱克多巴胺的衍生蒸发剩余物,加012MLBSTFA1TMCS，加盖于旋涡混合器上震荡，氮气吹干，加02ML甲苯溶解，在4000R/MIN下离心10MIN。取适量的莱克多巴胺标准溶液，DB33/T432A102检测A1021色谱条件色谱柱HP5MS5苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱30M025MM025M；进样口温度300，柱温程序初温150，保持3MIN，然后以10MIN升至230，保持10MIN，再以20MIN升至280保持10MIN；载气为高纯氦气（99999），流速10ML/MIN，不分流进样。A1022质谱条件EI源源温230；电子能量70EV；接口温度280；电子倍增器电压1506V；质量扫描范围30U550U；选择离子监测方式（SIM）；监测离子（M/Z）267、250、179、502。溶剂延迟5MIN。A103结果计算定量方法采用单点或多点校准法定量。莱克多巴胺（以莱克多巴胺计）XM1D/M。X尿样中莱克多巴胺含量NG/ML。M1质谱测定对应的莱克多巴胺含量NG/ML。M取样量ML。D稀释倍数。DB33/T432A63）。C69每个微孔加150UL配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴30MIN。C610每个微孔加入50UL中止液，混匀后30MIN内在450NM检测吸光度。C7结果计算根据下列公式进行结合率的计算标准的吸光度值或样品空白孔的吸光度值X100（B/B0）吸光度值零标准的吸光度值空白孔的吸光度值将标准品的B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（），横坐标为浓度（NG/ML）。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。而要获得样品中氯霉素的PPB（NG/G）浓度值还需要乘上相应的稀释因子（110）。本方法检测限为50NG/KG。C8注意事项C81试剂盒应放在28保存。C82为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。C83温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。DB33/T432200314附录D（规范性附录）可食性动物组织中己烯雌酚的检测方法（ELISA法）D1测定原理分析反应在羊抗兔IGG包被的微孔中进行，抗己烯雌酚抗体、己烯雌酚的酶标物、己烯雌酚标准品或样本加入后，4下温浴过液，清洗去除未结合的酶标物，加入酶标底物（H2O2）和显色剂（TMB），温室下避光温浴30MIN，加入反应终止液会使微孔中的兰色变黄色，在450NM处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得样本中己烯雌酚的浓度值。D2试剂和材料D21己烯雌酚酶联免疫试剂盒意大利TECNA公司生产或类似产品。D22醋酸乙酯。D23叔丁基甲基醚（TERTBUTYLMETHYLETHER）。D3仪器和设备D31离心机。D32组织均质仪。D33酶标仪（含450NM滤光片）。D34适宜的微量进样器和吸头。D4样品处理一份肌肉或肝脏切碎与三份水一起均质化1G均质物（相当于025G肌肉）用2ML叔丁基甲基醚（TERTBUTYLMETHYLETHER）涡旋混合提取。20，000G离心30分钟，冷冻。分离有机液相并蒸干。用1ML稀释液溶解，涡旋后，用于分析检测（最后的稀释度14）。D5工作液的准备D51标准品溶液浓度序列如下00102121020NG/ML。D52已烯雌酚酶标物本品是浓缩物，酶标物经过稀释以后稳定性降低，因此要根据用量进行稀释。本浓缩物可以用稀释液稀释100倍（即10UL酶标物990UL稀释液）。D53清洗液清洗液经过10倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。D54稀释液经过10倍的浓缩，请用蒸馏水稀释。D55中止液。D56已烯雌酚抗体冻干的抗体用6ML稀释液溶解后彻底混匀，使用后请立即在28避光保存。D57显色底物溶液本溶液应该在使用前根据用量由H2O2和TMB等体积混合。D6实验步骤D61使用前将试剂盒恢复到室温（约1小时）。DB33/T432200315D62预先进行编号，标记B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。D63用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复3次，在吸水纸上拍打将微孔中的液体去除。D64空白孔加150UL稀释液，标准孔加50UL标准品溶液，样品孔加50UL样品。D65所有微孔加100UL稀释的酶标物。D66除空白孔外，每个微孔加入100UL已烯雌酚抗体溶液。D67混匀后在28温浴过夜。D68温浴完成后清空微孔，并清洗3遍（按53）。D69每个微孔加150UL配好的显色底物溶液，混匀后避光室温下温浴30MIN。D610每个微孔加入50UL中止液，混匀后30MIN内在450NM检测吸光度。D7结果计算根据下列公式进行结合率的计算标准的吸光度值或样品空白孔的吸光度值X100（B/B0）吸光度值零标准的吸光度值空白孔的吸光度值将已烯雌酚标准品的B/B0值在半对数曲线中作出一标准曲线，纵坐标为结合率（），横坐标为浓度（NG/ML）。各样品的结合率通过该曲线都可以定量到一个浓度值。而要获得样品中已烯雌酚的NG/ML浓度值还需要乘上相应的稀释因子（14），这是基于抽提回收率为100的假设。本方法检测限为100NG/KG。D8注意事项D81试剂盒应放在28保存。D82为分析人员安全，操作时要戴上医用乳胶手套。D83温浴时请避免光线直照，应该用盖子盖住微孔板。DB33/T432200316附录E（规范性附录）可食性动物组织中磺胺类的检测方法（ELISA法）E1测定原理分析反应在抗磺胺类药物抗体包被的微孔中进行。标准品、样品和酶标物加入微孔后，在首次温浴中，标准品或样品游离的磺胺类药物分子与磺胺类药物酶标物竞争与抗体结合点结合。首次温浴后，没有结合的分子被清洗去，酶在第二次温浴中可以使无色的显色剂变兰，再加入反应终止液会使微孔中的兰色变黄色，在450NM处进行吸光度测量，通过计算比例可以获得样本中磺胺类药物的浓度值。E2试剂和材料磺胺类药物酶联免疫试剂盒意大利TECNA公司生产或类似产品。E3仪器和设备E31离心机。E32组织均质仪。E33酶标仪（含450NM滤光片）。E34适宜的微量进样器和吸头。E4样品处理组织（肌肉、肝脏和肾脏）取1G样本加入9ML稀释液；在组织均质仪中均质化；2000G离心5MIN或过滤，用上清液或过滤液直接检测（最后的稀释度110）。E5工作液的准备E51标准品溶液。E52酶标物用12ML酶稀释液缓慢溶解，等待4小时，然后用正倒方法换匀，注意不要用涡旋。E53清洗液用蒸馏水10倍稀释。E54稀释液用蒸馏水10倍稀释。E55中止液已经备用。E56显色液用柠檬酸缓冲液120（119）稀释显色剂，在使用前准备。E6实验步骤E61使用前将试剂盒恢复到室温（约1小时）。E62预先进行编号，标记B0、空白、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测。E63空白孔加200UL稀释液，B0孔中加入100UL稀释液，标准孔加100UL各标准溶液，样品孔加100UL样品。E64除空白外，所有微孔加100UL稀释的酶标物。E65混匀后在室温（2025）温浴10MIN。DB33/T432200317E66用可挤压的瓶子将清洗液加满微孔，翻转微孔板倒去液体，如此重复3次，在吸水纸上拍打将微孔中的液体去除。E67每个微孔加200UL配好的显色液，混匀后避光室温下温浴10MIN。E68每个微孔加入50UL中止液，混匀后60MIN内在450NM检测吸光