第四章电泳技术ppt课件

.,1,第四章电泳技术,.,2,1电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。2电泳技术优点：快速、准确、重现性好3电泳方法分类按电场分：常压（500V，适用小分子）支持体分：自由电泳、区带电泳仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式4电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）,.,3,一电泳的基本原理,电泳分离：移动方向：带电性质决定泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt影响的因素：1颗粒本身：带电、大小、形状2外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。,.,4,二纸电泳,以滤纸为支持体的电泳技术操作要点：1选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响A分离蛋白质，pI5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸醋酸，pH5.9C分离核苷酸巴比妥醋酸pH2.5，柠檬酸pH23D分离糖类：HAC-NaAC,pH35,.,5,2滤纸的选择与处理层析用滤纸，纸宽23cm/样品组分，长短影响电场强度。3点样点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）干法、湿法4电泳电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间5显色及分析蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红BAa：茚三酮、靛红核酸：紫外光下观察一般洗脱定量,.,6,三薄膜电泳,支持体：薄膜优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析操作1薄膜的处理与放置2点样平衡3电泳：E1025V/cm，0.52h4显色,.,7,四薄层电泳,将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等操作：1缓冲液选择离子强度较高的缓冲液2支持物处理精制品3薄层板制作4加样：挖沟、混合样品、填埋5电泳6分析：印染法,.,8,五凝胶电泳,支持物：多孔凝胶聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳,.,9,.,10,.,11,1聚丙烯酰胺凝胶的制备丙稀酰胺（单体）N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）（催化剂）聚合催化剂：（1）过硫酸铵四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黄素（VitB2）光改变单体浓度可改变凝胶孔径交联剂对孔径有影响：5最小根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。,.,12,2不连续电泳中样品压缩成层的原理不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液：样品胶：大孔径，pH6.76.8Tris-HCl缓冲液浓缩胶：与样品胶相同分离胶：小孔径，pH8.88.9Tris-HCl缓冲液,.,13,样品压缩成层原理：电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸HCl(解离）Cl，Cl泳动速度最快（快离子）CH2(NH2)COOH(样品胶、浓缩胶pH6.76.8）CH2(NH2)COO（0.11.0）泳动速度最慢（慢离子）蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间电泳时，Cl超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区较高电位梯度P和慢离子加速移动P压缩成层样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测），CH2(NH2)COO增加，泳动速度增大，很快超过P，P在均一的电位梯度和pH条件下分离,.,14,SDS-凝胶电泳原理,聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。分离测定：测分子量（与标准蛋白比较）鉴定样品纯度（条带数目）测定样品P含量：扫描定量（比色）,.,15,凝胶电泳的操作要点,1凝胶制备2电极缓冲液3样品处理及加样4电泳5染色与固定6脱色7分析,.,16,.,17,.,18,烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化,.,19,六等电点聚焦电泳,电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。,.,20,1稳定的pH梯度的形成2两性电解质载体要求：由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体）3支持pH梯度的介质密度梯度溶液（用于自由电泳）凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）4操作要点pH梯度支持介质的制备聚焦电泳检测两性电解质载体的除去,.,21,电泳技术思考题,1名词解释电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、相对迁移率、不连