细胞生物学第十五章 干细胞及其应用.ppt

干细胞,医学细胞生物学,授课教师：丰慧根E-mail：fenghuigen,2,引言,1998年，美国人Thomson和Gearhat各自成功地从人类胚胎和胎儿细胞中分离出了人类胚胎干细胞。,1999年，杂志将干细胞的研究评为世界十大科学成就之首,列在了人类基因组工程之前。,Thomson和Gearhart采用不同的途径成功培养干细胞的过程。,3,引言引言,2000年，西北农林科技大学在国际上首次得到人类心脏跳动样细胞团，标志着我国干细胞研究挤身于世界先进水平。2001年底，又将干细胞研究置于值得关注的六大热门科技领域之首。2002年3月，美国麻省理工学院首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管。国内干细胞的研究先后得到了国家自然科学基金，国家“九五”攻关、“973”项目等的大力资助。,引言,第一节干细胞生物学,4,一、干细胞的概念及分类,（一）干细胞概念,指细胞分化过程中出现的具有分裂增殖能力，能保持不分化状态，并能分化产生一种以上“专业细胞”的原始细胞。,（二）干细胞的分类胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES细胞）：指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。成体干细胞：在成体组织内具有自我更新能力及能分化成一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。,第一节干细胞生物学,第一节干细胞生物学,囊胚的内细胞团,第一节干细胞生物学,二、干细胞的特点（一）干细胞的形态和生化特点,形态特点：圆形或椭圆形，体积较小，核质比较大，核中多为常染色质。,生化特点：a.具有较高端粒酶活性;b.具有不同的生化标志：角蛋白15、nestin（巢素蛋白）。,第一节干细胞生物学,（二）干细胞的增殖特点1.缓慢性,干细胞,过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的中间态细胞。它可以起到通过较少的干细胞产生较多的分化细胞的作用。,问：干细胞增殖的缓慢性有何生物学意义？,分化细胞,过渡放大细胞,第一节干细胞生物学,2.自稳性（self-maintenance）指干细胞在生物个体的生命历程中自我更新，并维持其自身数目恒定的特性。,干细胞的分化与其突变后产生肿瘤恶性程度的关系,干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂,第一节干细胞生物学,对称分裂（symmetrydivision）,不对称分裂（asymmetrydivision）,干细胞分化细胞,干细胞分化细胞,第一节干细胞生物学,（三）干细胞的分化特1.多潜能性,第一节干细胞生物学,在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能,第一节干细胞生物学,（中胚层）骨、软骨、平滑肌、横纹肌,人胚胎干细胞具分化的多潜能性,第一节干细胞生物学,2.去分化和转分化的能力,例：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌鼠体内，3天后在雌鼠的神经胶质细胞中检测到Y染色体的存在，证明成体动物的造血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。,例二：造血干细胞向骨骼肌细胞的转分化,第一节干细胞生物学,（四）干细胞的分离与纯化1.通过干细胞表面的标记分子进行造血干细胞标记物为CD34等；神经干细胞的巢素蛋白。2.通过干细胞不同于一般分化细胞的物理特性进行干细胞不被Hoechst33324和Rhodamine123染色。,第一节干细胞生物学,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,（一）胚胎干细胞的研究历程,一、胚胎干细胞,1970年，MartinEvans从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外培养。1995年，美国从恒河猴囊胚中分离并建立了第一个灵长类动物的胚胎干细胞系。1998年，美国Thomson和Gearhat从体外受精形成的囊胚中及从59周龄流产胎儿的性腺脊和肠系膜中建立了人胚胎干细胞系。同年，我国中山医科大学李树浓教授的课题组成功地建立了人胚胎干细胞系。,（二）人胚胎干细胞(hES)的特点,形态：圆形或椭圆，体积较小，核质比较大，体外抑制分化培养时成鸟巢状，集落生长并紧密堆积，细胞界限不明显。,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,永生化,增殖速度：36h分裂增殖一次。hES必须在含有白血病抑止因子（LIF）的培养基及成纤维细胞饲养层(freedercell)条件下才能保持繁殖而不分化hES体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化,可诱导分化为各种成体干细胞；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；不被Hoechst33342和Rhodamine123染色。细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3，SSEA-4等。,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,（三）人胚胎干细胞的来源与鉴定1.来源a.取自终止妊娠的胎儿的性器官组织。,Gearhart法,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。,Thomson法,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,c.通过体细胞核转移技术获得,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,胚胎干细胞系的建立过程,分离囊胚的内细胞群,分离胚胎生殖腺脊细胞,与成纤维细胞共培养ES细胞非分化增殖,胚胎干细胞的鉴定,定向诱导分化,成体干细胞,功能细胞,a.具有正常稳定的二倍体核型和带型。b.具有较高的端粒酶及碱性磷酸酶活性。人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高，说明其可在体外未分化状态进行长期培养。C.不被Hoechst33342和Rhodamine123染色d.能分化成三个胚层的细胞，可诱导分化为各种成体干细胞。,2.鉴定,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,e.人胚胎干细胞有特异性表面抗原的表达,鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。Gearhart等认为SSEA-1阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志。,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,成体动物的许多组织和器官具有修复和再生能力，成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,二、成体干细胞,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小，类似小淋巴细胞，约75处于G0期。主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。人造血干细胞表面标志：CD34（表达KDR血管内皮生长因子受体）、CDw90。“时间”上有HSC（呈KDR）,祖细胞（呈KDR-）、前体细胞、功能血细胞的分化阶段。我国已能用异体外周血干细胞移植代替骨髓移植来治疗白血病。,1.造血干细胞(hematopoiticstemcell，HSC),第二节胚胎干细胞与成体干细胞,细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突。NSC可增殖分化出中枢神经系统的三种基本细胞：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞的生化标记巢素蛋白及波形蛋白。,2.神经干细胞(nuralstemcell，NSC),第二节胚胎干细胞与成体干细胞,成体中枢神经系统的下脑室区、嗅球、海马中存在NSC。NSC的发现，为帕金森病等神经退形性疾病、脊髓损伤的治疗及组织工程中的细胞来源带来新的契机。,第二节胚胎干细胞与成体干细胞,第三节干细胞的医学应用及研究状况,一、干细胞的医学应用（一）干细胞治疗的途径,1.一次性介入，永久性治疗；2.不需要完全了解疾病发生的确切机理；3.可应用于自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。,（二）干细胞治疗的特点,第三节干细胞的医学应用及研究状况,最适合于治疗组织坏死性疾病、退行性病变、自体免疫性疾病等。美国科学家已从脂肪组织中成功提取出干细胞，使人们看到了用干细胞临床治疗疾病的曙光。干细胞可以进行横向分化，多家实验室证明了人的骨髓干细胞可以横向分化为肝脏细胞、肌肉细胞、神经细胞等。,（三）应用前景,第三节干细胞的医学应用及研究状况,胚胎干细胞及其向神经细胞、肝细胞等的诱导分化研究，为发育中基因表达和调控、人体生物工程、药物毒性的研究等方面开辟了广阔的应用前景。,干细胞的横向分化,第三节干细胞的医学应用及研究状况,干细胞应用干细胞移植与细胞治疗,二、我国和世界其他国家干细胞研究状况,（一）我国的干细胞研究进展1998年，我国先后将人胚胎干细胞诱导成了浆细胞、造血干细胞。1999年，小鼠胚胎干细胞系在上海建立。2000年，西北农大在国际上首次得到人类心脏跳动样细胞团。,第三节干细胞的医学应用及研究状况,2002年8月，西北农林科技大学细胞工程技术研究中心主持的国家重大科技项目“牛和人类胚胎干细胞的研究”成果达到了国际先进水平，其中部分成果在国际上属于开创性研究成果。,第三节干细胞的医学应用及研究状况,新雅干细胞库,“细胞研究是生物科技的最前沿,是最有希望超越西方发达国家的领域。希望你们担起这个重任让一个国家、一个民族在一个大的科学领域领先世界！”,美国1998年人胚胎干细胞系在体外的建立，带动了全世界的干细胞研究热潮。大批美国公立私立机构已经可以从骨髓、胚胎、脂肪、胎盘和脐带等渠道获得干细胞。,（二）世界各国干细胞的研究状况,第三节干细胞的医学应用及研究状况,奥巴马推翻布什八年禁令美联邦资金将用于干细胞研究,英国第一个将干细胞研究合法化；政府牵头，联合大药厂、大学、研究机构、公司共同形成干细胞基础与临床研究网络，力求在该领域的领先地位。日本日本把干细胞技术视作在生命科学和生物技术领域赶超欧美国家的绝好机遇；在2000年启动的“千年世纪工程”中，将干细胞工程作为四大重点之一。德国、新加坡、澳大利亚等多个国家也把干细胞研究作为生物高技术研究的重点，制定了短期和长期的发展计划，投资建了大批专业干细胞工程技术研究中心。瑞典、巴西2005年均通过立法继续支持干细胞研究。根据前期小规模临床研究鼓舞人心的结果，巴西政府牵头，于2005年在全国进行一项多中心1200病例的用干细胞治疗心脏病的临床应用研究。韩国、俄罗斯等国的干细胞研究也倍受资助。韩国干细胞研究在黄禹锡事件后也迅速恢复再度成为资助重点。澳大利亚治疗性干细胞研究合法化。通用电器与强生等跨国公司也涉足干细胞研究。,英国第一个将克隆研究合法化，允许克隆胚胎进行干细胞研究，也可培养研究用胚胎，定性为“治疗性克隆”。但研究中使用过的所有胚胎必须在14天后销毁。,以色列允许破坏胚胎以进行干细胞研究，首次成功用人类胚胎干细胞培育出了能自然跳动的心脏细胞。,第三节干细胞的医学应用及研究状况,干细胞研究的国家分布分析,45,美国发表的文献占干细胞研究总文献量的比例超过39%，以绝对优势稳居全球干细胞研究领域的首位。亚洲共有三个国家进入前10位，分别是日本、中国和韩国，其中中国位居全球第