米曲霉的培养及蛋白质的分析

，米曲霉培养和蛋白质分析，第一，实验目的，通过固体三角瓶培养曲霉，掌握固体培养微生物原理和技术，掌握蛋白酶活性分析方法。第二，实验原理、过程和方法，第一，实验原理2，实验过程3，实验方法。1、实验原理、固体培养微生物是中国传统发酵工业的特点之一，具有悠久的历史。在黄酒、白酒、酱油、酱等中广泛使用。固态培养方法：(Solidstatecultivation):主要有山岳法和块法。一些黄酒曲、红曲和酱油曲霉文化三曲法；黄酒曲和白酒曲通常采用组块唱法。固体歌唱设备：实验室主要使用三角瓶或茄子瓶培养。种子扩张培养将蒸好的材料放入竹浆中，接种后温度和湿度都在调节的培养室中培养。目前，产业界主要普及厚层通风救济曲、旋转盘固态培养装置；日本台湾已经大规模机械化。固体培养微生物：主要用于真菌的培养，但细菌和酵母也可以使用这种方法。主要优点是节能，不污染废水。单位体积的生产效率高。我国广泛使用的厚通风固体状态法培养法，空气一般不经过杀菌过程，培养环境也不处于严格的无菌状态。因此，染色问题没有从根本上解决。本实验中使用的米曲霉的生长特性和菌落特性：米曲霉(米曲霉)。群体最初由白色、黄色、黄褐色变成黄褐色，反之则变成无色。2，实验过程，曲霉种的纯化(单菌落分离)，建立斜面，培养出250ml三角病的斜菌株，种粮扩张培养(500ml)三角病。米曲霉培养由水溶液提取，制备了粗酶制剂，采用粗酶制剂测定了蛋白酶活性。3，实验方法，曲霉的培养，实验分为斜种子培养和三角病培养两个阶段。三角瓶培养物经常在工厂用作主要种子。试管倾斜培养基：豆饼淋溶汁：加入100克豆粉、500毫升水，浸泡4小时，煮3-4小时，纱布自然过滤，取液体，调节至5波美度。加入2克可溶性淀粉，0.1克磷酸二氢钾，0.05克硫酸镁，0.05克硫酸铵，2克琼脂，天然pH。或者使用土豆培养基：土豆200克葡萄糖20g琼脂15-20g水到1000mlpH自然。曲霉培养基1:麦麸80g，面粉(或面粉)20g，水80ml；米曲霉培养基2，豆粕粉10g，麦麸90g，水110毫升；装载厚度：1厘米左右；杀菌：120，30-60分钟；准备三角瓶徽章：接种和米曲霉培养条件：米曲霉固体培养主要控制条件：温度、湿度、负荷、基质含水量。固体培养前，原料的蒸煮和杀菌是同时进行的。实验室通常在高压灭菌锅里进行。但是在工厂，原料的烹饪、杀菌和发酵分别在不同的设备上进行。这不同于液体发酵。培养28-30 后20小时内，菌丝体应装满培养基，第一次摇晃瓶子，放松培养基，每8小时确认一次，摇晃瓶子。培养时间一般为48-70小时。第三，实验仪器、设备和材料、恒温培养箱或固态培养室、负压超清洁工作台、显微镜、计数器、水锅、分光光度计、试管、茄子瓶、平板、500毫升三角瓶等。米曲霉种(用于酱油生产的米曲霉)，4，实验分析项目和方法，1，米曲霉培养效果测定：米曲霉孢子数(显微镜观察)；一般来说，每克孢子数超过100亿。2，干物质失重测定，干重量无=发酵前干重量-发酵后干重量，3，曲霉蛋白酶活性测定，3.1原理(1)，福林试剂在碱性情况下很不稳定，可被酚化合物还原，产生蓝色反应。(2)蛋白质分子含有酚基氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氦酸等)。(。(3)，以酪蛋白为基质，与酶液反应。经过一定时间后，添加三氯乙酸终止酶反应，沉淀残留的茶碱，与水解物分离，过滤后带来滤液。用碳酸钠碱化后添加福林试剂显色，用分光光度法测定。(4)，蓝色反应的强度与蛋白质水解物的数量成正比，水解物的数量与酶活性成正比。因此，根据蓝色反应的强弱，可以推测出蛋白酶的活性。3.2试剂(1)福林试剂在2000毫升小麦回流装置中，钨酸钠(Na2WO42H2O)100g，钼酸钠(NaMoO42H2O)25g，水700毫升，85%磷酸50m1，浓111.如果加入硫酸锂(li2 so 4)150克，蒸气50m11，混合冷凝器，再加入几滴液体溴，煮沸l5min，赶走残留溴，去除颜色，溶液必须为黄色，而不是绿色。如果溶液中仍有绿色，必须滴溴液。再煮一次，然后去掉。冷却后溶解为1000毫升。过滤器，放在棕色瓶子里保存。这种溶液将蒸馏水加2倍，用作稀释的福林试剂。(2)0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液取三氯乙酸65.4g，定为1000毫升。(3)据说，0.4毫升/L碳酸钠溶液中，无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g少量至1000m1。(4)0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液a液体：10.6g80-90%乳酸和蒸馏水固定容量1000ml。B-液体：16克铝酸钠和70%蒸馏水为1000毫升，一定量。液体16ml和b液体1ml稀释1倍0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液。(5)取2%酪蛋白2g，将0.1毫升/L氢氧化钠放入浴缸加热融化后(如有必要，用小火加热煮沸)，用pH2.5乳酸-乳酸酸钠缓冲液，至1000毫升为一定量。准备后要及时使用或放入冰箱保存。否则，细菌容易繁殖，引起变质。配制酪蛋白溶液时，泡沫太多，可以添加1-2滴酒精包裹。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的制备，应加2-3滴乳酸的湿润性。(6)准确地说，100g/m1酪氨酸溶液在l05烤箱中烘烤到一定量的酪氨酸0.1g，然后逐渐添加0.1mol/L盐酸(HCl)溶解，将蒸发数固定在100m1到1000g/m1的浓度。10ml是蒸馏水，最高可达100ml，含有100g/m1酪氨酸溶液。此溶液应立即使用，或放入冰箱保存，以免细菌繁殖变质。步骤3.3，绘制3.3.1标准曲线，(1)逐表准备不同浓度的酪氨酸溶液，(2)取其他6个试管，分别获得不同浓度的酪氨酸1毫升，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，加入稀福林试剂1m1。放入浴缸，用40保温发色20min摇晃，在波长660nm处测定吸光度。一般测量3次，然后取平均值。以吸光度为纵坐标，以酪氨酸浓度为横坐标，绘制为标准曲线。将蛋白质分解酶固态发酵的湿曲2g准确地用10-20ml蒸馏水浸泡3030分钟，然后用滤纸过滤。用一定的倍数稀释滤液(最好在0.2-0.4的范围内测量光的密度)。3.3.2酶液制备，4个试管，每个1毫升稀释酶液1个空白管，3个平行试管，在40水浴中预热3-5min。在3个平行试管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，绝热10分钟。立即添加2ml0.4M三氯乙酸溶液，用滤纸过滤l5min。各吸收1ml清液，添加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，在40 的水浴中放出20min的颜色。空管中先放入2ml0.4M三氯乙酸溶液和lml2%酪蛋白溶液，15分钟后用滤纸过滤。以下操作与平行试管相同：以空管为标准，在680纳米波长下测量光的密度，得出其平均值。3.3.3测定，蛋白质酶活性单位定义：40，pH2.5中，酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为每分钟水解酶1单位。，中心：k:在标准曲线上，与od值1对应的酪氨酸微克数；OD:平行测试管的平均光密度；4:试管的反应流体总体积(ml)；10:反应10分钟；n:稀释倍数；w:对曲的称谓(克)、3.3.4计算、(1