重庆医科大学学生创新实验项目

重庆医科大学学生创新实验项目 申 请 书 项目名称：造血干细胞移植促视网膜血管新生申 请 者：潘炜 王振龙 叶姗 蓝明平 杨俊松 赵停婷 田中 吴静 张文倩指导教师：李芳菲单 位：基础医学实验教学中心电 话：申请日期 ：2009年9 月 15日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称造血干细胞移植促视网膜血管新生所属学科生理学申请金额 3000元起止时间2010年3 月至2010 年10 月项目性质学生自选研究课题型科研小组成员姓名性别年级电话及电子邮箱潘炜男07级儿科一班 王振龙男07级儿科一班叶姗女07级儿科二班蓝明平男07级儿科一班杨俊松男07级临床二系赵停婷女07级临床二系田中男07级临床二系吴静男07级临床二系张文倩女07级临床二系指导教师李芳菲女副教授 研究内容和意义简介(400500字)实验内容： 1. 造血干细胞分离、培养：本实验室常规方法进行分选。 2. 造血干细胞标记：将待移植细胞用 ER-Tracker Red 红色荧光探针进行活细胞标记。 3. 造血干细胞移植：将1105 HSCs经玻璃体注射至新生小鼠 4. 移植后48h、72h进行FITC-dextran心内灌注、视网膜铺片，用Whole mount的方法观测视网膜血管形成及外源造血干细胞的组织定位。 5. 免疫荧光的方法检测移植后造血干细胞中内皮细胞特异性标志的表达。 意义：为阐明造血干细胞促进血管新生的过程及机制提供重要线索。关键词：造血干细胞 移植 血管新生 免疫荧光 荧光显微镜 一、立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献)立论依据 血管形成是发育和生长必经的生理过程，在损伤修复等过程中起重要的作用，同时也参与肿瘤、炎症、类风湿和糖尿病视网膜病等病理过程。在胚胎发育过程中，前体细胞（Angioblasts）经分化形成内皮细胞，进而形成血管，这一过程称为血管发生（Vasculogenesis）。血管的成熟及血管网络的形成依赖于血管形成（Angiogenesis）的过程，即已存在的初级血管中的内皮细胞经过增殖和迁移形成新的血管，它不仅存在于胚胎发育过程中，也是成体新血管形成的主要方式。 以往的研究认为内皮细胞前体只存在于胚胎期，但是最近的研究发现在成体骨髓和外周血中也存在内皮细胞前体细胞。骨髓内富含的造血干细胞可能在血管形成过程中发挥重要作用（图）。但其促进血管新生的具体过程和机制并不是分清楚。 造血于细胞移植治疗疾病临床应用时间短，病例数不多，经验不足，有许多问题尚待研究：第一，干细胞具有多种分化方向，移植的干细胞是否会引起其他问题，如移植的干细胞是否会在移植部位分化为其他组织如骨组织或出现肿瘤样生长?是否会促进体内潜在恶性肿瘤及血管瘤的生长?是否会促进糖尿病眼底病变的恶化甚至失明?尽管目前报道的临床研究尚未观察到严重不良反应，但样本量太小，时间尚短，这些安全方面的问题必须得到密切关注。第二，造血干细胞分化为内皮细胞的具体机制尚不清楚，这对于细胞用于临床治疗是重要的挑战，如何继续探讨造血干细胞的可塑性机制的证据，如何优化其向血管内皮细胞定向分化的条件，移植的数量、种类、移植途径与疗效的关系及移植的准确作用机制，仍需要加强基础研究。第三，干细胞移植治疗缺血性疾病的远期效果如何，还需要多病例的累积和长时间的随访。视网膜血管由于其结构相对简单，发育模式清晰，是研究血管形成最常用的模型。糖尿病性视网膜病变、高血压性视网膜病变等视网膜血管病也是临床上的常见疾病。因此研究造血干细胞在视网膜血管新生过程中的作用，具有重要的理论和实际意义。本实验分别采用不同波长的荧光标记视网膜血管和外源造血干细胞，观察造血干细胞移植后在新生血管内的定位。并且用免疫荧光的方法考察移植前后造血干细胞向内皮细胞的分化。将为阐明造血干细胞促进血管新生的过程及机制提供重要线索。 图 造血干细胞促进血管新生示意图 （Urbich and Dimmeler，Circulation Research August 20, 2004） 参考文献邵琴 ，王长谦 造血干细胞与血管新生研究进展，国外医学（心血管疾病分册），2004，31（1）任玮，左丽，钟志强。免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117,贵阳医学院学报，R446.6-3郑艳，卓光生，造血干细胞血管化及其在血管新生治疗的临床应用，医学终述2007年12月第13卷第23期 韩忠朝，造血干细胞的血管分化及其在肢体缺血性疾病中的治疗作用，中国医学科学院学报，R329.28 李娟娟，张美霞，光动力法诱导大鼠视网膜新生血管的建立，国际眼科杂志，2008年9月，第8卷，第9期Urbich and Dimmeler，Circulation Research August 20, 2004二、研究方案1.研究目标、研究内容、研究方法：研究目标：探究造血干细胞移植促进血管新生的过程及机制 研究内容：造血干细胞分离、培养 造血干细胞标记 、移植 观测视网膜血管形成及外源造血干细胞的组织定位 移植后造血干细胞中内皮细胞特异性标志的表达 研究方法：材料 C57BL/6小鼠。 抗体：CD45、CD34、CD31（B&D公司）；ER-Tracker Red 红色荧光探针（李芳菲博士提供）； FITCdextran（Sigma公司） 设备：超净工作台、磁珠分选仪、荧光显微镜、激光共聚焦等。 1.造血干细胞(HSCs)分离培养：取小鼠股骨、胫骨，冲洗骨髓腔,收集细胞，磁珠分选得到Lin- CD117 + HSCs。对收集的造血干细胞进行培养。2造血干细胞标记：将待移植的细胞用ER-Tracker Red 红色荧光探针进行活细胞标记。3.造血干细胞移植：1 105 HSCs经玻璃体注射至新生小鼠。4.移植后48h和72h对受体小鼠进行FITCdextran心内灌注5.灌注成功后，视网膜铺片，在荧光显微镜下观察血管形成及外源造血干细胞在新生血管中的定位。6.免疫荧光方法检测移植后造血干细胞中内皮细 胞特异性标志的表达。2.拟解决的关键问题：探究造血干细胞移植后在新生血管内的定位以及移植前后造血干细胞向内皮细胞的分化情况，将为阐明造血干细胞促血管新生的过程机制提供重要线索。3.研究技术线路：对收集的造血干细胞进行培养。让造血干细胞与配置好的ER -TRACKER RED 进行孵育15分钟到30分钟。取小鼠股骨、胫骨冲洗骨髓腔,收集细胞，经磁珠分选后得到造血干细胞磁珠分选得到Lin- CD117 + HSCs。1 105 HSCs经玻璃体注射至新生小鼠。移植后48h和72h.对受体小鼠进行FITCdextran心脏灌注：FITCdextran溶于无菌生理盐水中。将小鼠常规麻醉固定，剪开胸骨，打开胸腔，将1mL FITC dextran溶液（分子量：2106，50g/L），注入左心室，观察小鼠的口、鼻、耳廓变黄为灌注成功。灌注成功后，视网膜铺片，在荧光显微镜下观察血管形成及外源造血干细胞在新生血管中的定位。免疫荧光方法检测移植后造血干细胞中内皮细胞特异性标志的表达。4.可行性分析： 1本课题组长期从事干细胞生物学研究，分离、培养造血干细胞的经验丰富。 2本实验得到重庆医科大学基础医学院及实验教学中心的支持，具备完成该实 验的场地和设备 3被课题组已取得部分前期研究结果（图2，A-B） 5.技术关键：造血干细胞的分离与培养 造血干细胞的移植 荧光显微镜观察血管形成以及造血干细胞的定位 免疫荧光方法检测造血干细胞中内皮细胞特异性标志的表达6.研究工作进度安排：2010年3-7月：造血干细胞分离、培养；造血干细胞标记 、移植。 2010年7-8月：视网膜血管形成及外源造血干细胞的组织定位 。 2010年8-10月：移植后造血干细胞中内皮细胞特异性标志的表达 。整理分析，撰写文章。7.本实验特色和创新：1.分别采用不同波长的荧光标记视网膜血管和外源造血干细胞，能动态，真实地观察到造血干细胞移植后在新生血管内的定位。2用免疫荧光的方法考察移植后造血干细胞向内皮细胞的分化情况。将为阐明造血干细胞促血管新生的过程及机制提供重要线索。8.预期研究结果： 造血干细胞定位于新生血管分化为内皮细胞参与血管的形成。三、研究基础1. 1.与本项目有关的工作基础：2. 重庆医科大学干细胞研究中心提供实验设备，成熟的实验指导和生物技术。 3. 2.已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径：4. 本实验所需的动物由动物实验中心提供。本实验所需的设备由创新实验室和 重庆医科大学干细胞研究中心提供。四、经费预算申请资助金额3000元自筹经费来源及金额学校支 出 科 目金 额计 算 根 据 及 理 由合 计3000抗体及荧光染料2000元，清洁级实验小鼠500元，其他耗材、数据采集和分析。实验材料费2000实验动物500药品试剂500其他 五、申请者承