蛋白质的修饰和表达

.,第三章蛋白质的修饰和表达,蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。,.,第一节蛋白质修饰的化学途径,蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变。,.,影响化学修饰的主要因素有两方面：1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。2、修饰剂的反应活性。,.,一、蛋白质侧链的化学修饰,在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。,.,蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。,.,（一）巯基的化学修饰由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前，常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解。其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯基。N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化。,.,5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度。,.,（二）氨基的化学修饰赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点。常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。,.,（三）羧基的化学修饰谷氨酸、天冬氨酸修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类。,.,（四）二硫键的化学修饰一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防止重新氧化成二硫键。,.,（五）其他侧链基团的修饰1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。,.,2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代反应。,.,3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰反应，但可以和二羰基化合物发生反应。,.,4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反应。,.,5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化。,.,二、蛋白质的位点专一性修饰,专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性。这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。,.,（一）亲和标记亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂可以专一性标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。,.,这类抑制剂可分为两类：一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合集团，同时还具有和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团。,.,另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”。,.,（二）光亲和标记这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。反应一般分两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。,.,三、蛋白质的聚乙二醇修饰,聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成，两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。蛋白质修饰中应用最多的是mPEG的衍生物。,.,PEG与蛋白质的非必需基团共价结合时，可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，避免抗体产生，或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的延长。,.,修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和羧基。,.,四、蛋白质的化学交联和化学偶联,化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间，也可发生于多个分子之间，而形成网状交联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。如戊二醛蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质。,.,蛋白质分子的固定化,蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一些不足，提高酶分子的稳定性。2、能与产物分开，有效地控制生产过程3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤，简化生产工艺4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。,.,酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋法、共价结合法去实现。1、交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺-2，2-二磺酸。,.,交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3）吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能集团偶联酶蛋白。,.,2、共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，以固定酶的方法。常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）,.,影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低温缓冲液中进行3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其他功能基团副反应尽可能少4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。,.,第二节蛋白质的分子生物学改造,蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。,.,一、基因突变技术,基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。根据改造策略的不同可以分为定点突变和定向进化两种，前者属于理性的设计方法，后者属于非理性的设计方法。,.,（一）定点突变对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入。具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。,.,1、重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。,.,.,为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是反应温度提高10-12度。,.,2、快速定点突变首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。再用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。,.,（二）定向进化在实验室中模仿自然进化的关键步骤突变、重组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统，可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。,.,1、制造突变体,（1）易错PCR基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某些组分的数量或质量，随机引入错误碱基从而创造序列多样性的DNA序列文库。关键在于选择适当的突变频率。一般目标基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想。由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果，因此常用连续易错PCR方法。,.,DNAshufflingallowsacceleratedevolutionofgenes,.,2、筛选,（1）表型观察选择和筛选菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平板上产生清晰的水解圈。在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下，根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高温的木聚糖酶。,.,（2）高通量筛选方法噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交系统等。,.,噬菌体展示技术是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。,.,Phagedisplaymethod(1),M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).,.,Phagedisplaymethod(2),.,Phagedisplaymethod(2):(contd.),.,核糖体展示技术和mRNA展示技术在体外无细胞翻译体系中进行，用mRNA的可复制性，使靶基因得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。大大提高了筛选通量。,.,二、基因融合和基因剪接,基本原则：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白质或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达。,.,1利用基因融合技术表达外源基因的缘由（1）通过与一特异性蛋白质或其特意的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯化。（2）通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白。（3）与报告分子的融合蛋白结合，应用于蛋白质定位或转基因动物。（4.）避免被蛋白水解酶水解（5）改变细胞溶解性，防止包涵体的形成（6）定向定位在宿主的不同区位。,.,2基因融合的策略（1）方式A酶切后，直接剪接到适当的信号肽之后B在目的基因两端分别加上不同的亲和标签，有利于蛋白纯化C将目标基因插入信号肽序列和一插入序列之间，成为一种可插入到细胞膜和细胞壁的蛋白编码。,.,（2）融合蛋白接头的设计和选择多个不同模块连接成一个大分子时，其中起连接作用的氨基酸链即为linker。因素：长度在10-15个氨基酸之间具有一定柔性避免产生二级结构选择非疏水性的氨基酸，常用序列为（GGGGS）3。,.,3、融合蛋白标签目的：为了重组蛋白质的纯化，目的蛋白质的监测和定向固定，提高重组蛋白质的产量，增加可溶性和稳定性等。常用片段：多聚精氨酸、多聚组氨酸、FLAG、c-myc等。这些蛋白不会与融合蛋白发生干扰。,.,4、融合蛋白报告分子目的：标定目的基因的表达调控应用：启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导、药物的筛选特点：1、报告基因应不存在于宿主中或易于和内源性基因相区别2、应当有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子3、报告分子的分析结果应具有很宽的线性范围，以便于分析启动子活性的幅度变化4、报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。,.,5、蛋白质剪接-内含肽内含肽：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合于前体蛋白的氨基酸序列。表达蛋白连接（内含肽介导的蛋白连接）：通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成C端带有硫酯键或N末端带有半胱氨酸的蛋白质分子。两种蛋白质混合以后，硫酯键和半胱氨酸利用自然化学连接的原理进行自发的连接反应，在硫酯键和半胱氨酸之间形成肽键，从而将两种蛋白质连接起来。,.,6、tRNA介导的蛋白质工程在蛋白质工程中，借助于校正tRNA定点掺入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息、改进蛋白质检测与分离的方法，甚至赋予蛋白质某些新的特征。增添一个非天然氨基酸到遗传密码中需要创建一套新的组分，包括tRNA、密码子和氨酰tRNA合成酶。迄今为止超过20个非天然氨基酸被掺入到遗传密码中。,.,例如，含有酮基的对乙酰苯丙氨酸。含有这个氨基酸的蛋白质能够选择性的被荧光标记用以跟踪和成像，或是被生物素标记用作灵敏度检出。许多试剂都可以通过酮基这个化学手柄选择的结合到目标蛋白上。,.,基因融合的用途,上述这些基因融合策略，主要是有利于外源基因的表达、表达产物的分离、纯化以及细胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用这些策略对蛋白质分子中的特定序列、结构元件乃至结构域通过基因剪接来进行操作。,.,第三节重组蛋白质的表达,重组蛋白质在大肠杆菌中的表达重组蛋白质在酵母细胞中的表达重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达,.,一、大肠杆菌中表达体系的优点,大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。,.,大肠杆菌表达体系的缺点,大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。,.,大肠杆菌表达体系的应用,当外源蛋白质的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于34个，以及不需要翻译后修饰而能保持其生物活性的蛋白质，大多可以利用大肠杆菌系统得到满意的结果。,.,1表达载体的构建,(1)复制起始点大部分载体是基于pBR322或pUC质粒的复制起始点，复制起点主要决定了细胞内质粒的拷贝数。前者可保持每个细胞中20-50个拷贝，后者为150-200个质粒。,.,选择性基因载体上至少含有一个选择性基因，一方面用于对转化体的确定，另一方面在培养过程中保持质粒的稳定性。一般为抗生素抗性基因或报道基因。,.,(3)强的、可诱导的启动子主要作用是促进转录的有效起始。原核细胞的启动子由-10区和-35区两部分组成。-10区是RNA聚合酶的牢固结合位点，-35区是RNA聚合酶的识别位点。,.,(4)强的转录终止序列高效表达的载体应该含有终止子，因为合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。,.,(5)核糖体结合位点原核微生物的mRNA结合核糖体的序列称为SD序列。SD序列对翻译效率有影响。,.,(6)合适的多克隆位点具有多个单一酶切位点的多克隆位点，便于外源基因插入和筛选。,.,2与外源基因有效表达的相关因素,有效的转录起始一个合适的高表达外源基因的启动子应符合以下几点：第一，必须是较强的启动子，表达效率在10-30%。第二，由启动子控制的本底转录很低。第三，启动子能够有一些简单及经济合算的方式诱导启动。例如：T7启动子,.,转录终止区对外源基因表达效率的影响转录终止有两种机制，一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板脱离。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖与模板上编码的信号。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成启动子的封堵。,.,（3）mRNA稳定性的影响mRNA的快速降解势必影响蛋白质的合成。通常用非常强的启动子来弥补不稳定的mRNA的转录物。,.,(4)密码子偏好性遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用其中一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子，不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子。富含E.coli不常用密码子的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。精氨酸tRNA是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。,.,5、表达定位外源蛋白可能定位于：胞内、胞质膜、胞周质、外膜和胞外培养基。（1）表达的外源蛋白定位于胞外小分子蛋白较易表达，产物接近天然蛋白；但表达大分子时，则易在胞内形成包涵体。蛋白质在细胞质中被降解的可能性比其他的定位要大得多。从细胞质蛋白混合物中纯化目的蛋白相对比较困难。,.,（2）细胞外周质表达有利于目的蛋白的纯化；有利于蛋白质的正确折叠；信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N末端；蛋白质降解也少。许多原核和真核细胞来源地信号肽已成功用于蛋白质从内膜到外周质的转运。如：E.coli的PhoA信号、人生长激素信号肽等。,.,（3）细胞外分泌易于纯化，减少降解方法：a、利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径，b、利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。,.,（4）外源蛋白表达定位在胞质膜上形成具生物活性的膜蛋白，大肠杆菌内膜上表达定位的G蛋白偶联受体，已用于受体与配基的结合、G蛋白与效应物的偶联、受体自身的结构等。,.,（5）表达外源蛋白定位于菌体表面定位方式：a、将外源肽插入大肠杆菌外膜蛋白的膜外区，使一些短肽在细菌表面呈现。B、将外源蛋白序列插入菌体表面的结构，如鞭毛和菌毛的蛋白中。C、以菌体表面脂蛋白或Lpp-OmpA融合体作为靶向载体蛋白，将外源蛋白或肽序列与脂蛋白或Lpp-OmpA的N端或C端序列融合，表达定位于菌体表面。,.,6、宿主选择对表达的影响宿主菌对外源基因的表达会产生一定的影响。例如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。Rosetta2系列可以补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的tRNA，提高了外源基因的表达水平。Origami2系列是硫氧化还原蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。,.,7、培养条件的控制对表达效率的影响蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统获得提高。高密度培养系统可以分为：分批培养、补料分批培养和连续培养。培养基的组分和培养参数会影响蛋白酶的活性、分泌和产量。培养基的特殊操作能显著提高蛋白质释放到培养基中。如培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中。,.,（三）真核基因在原核细胞中表达及调控需注意：1、基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的cDNA。2、基因必须置于原核细胞的启动子、终止子和SD序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别。3、产生的mRNA必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。,.,二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达,优点：1、既有原核表达系统操作简单、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点2、对外源蛋白的翻译后修饰,.,常用表达系统：甲醇酵母表达系统特点：1、具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启动子，可严格调控外源蛋白的表达。2、对表达蛋白进行翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性。3、表达量高。4、表达的蛋白既可以存在于胞内，也可以存在于胞外。酵母自身分泌的背景蛋白很少。5、整合有外源基因的重组子表达系统十分稳定。6、糖基化程度低，使得他的蛋白抗原性较低。7、对营养要求低，培养基成分简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。,.,（一）表达菌株常用菌株有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，均为甲醇诱导型，以甲醇为唯一碳源时，宿主菌中AOX1启动子被强烈诱导，是外源蛋白大量表达。蛋白酶缺陷株，如SMD1168，可以减少分泌蛋白的酶解消化，为外源蛋白的成功表达创造了条件。,.,（二）表达载体一般用整合型载体作为外源基因的表达载体。特点：载体与酵母宿主细胞基因组DNA整合，因此稳定性高，但基因的拷贝数量低这种载体被设计为穿梭载体，即它可以在大肠杆菌中保存、扩增和构建，线性化后又可转入酵母细胞中。,.,1、启动子AOX1启动子，仅受甲醇诱导，可产生较高水平的表达，但不适于食品生产，又有火灾隐患。现发现不以甲醇为唯一诱导物的启动子：GAP、FLD1、DAS、AOX2等。GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶基因）的启动子可以利用多种碳源如葡萄糖、甘油等。,.,2、选择标记一般有两种：营养缺陷型选择标记，如His4、Arg4等抗性选择标记，G418抗性基因,.,3、信号肽序列可以选择外源蛋白自身的信号肽和酵母本身的信号肽。,.,4、表达载体的转化及与毕赤酵母的整合载体首先以质粒的形式转化大肠杆菌并在其内进行扩增，经酶切和测序证明表达载体构建正确后，经DNA内切酶线性化后，转入巴斯得毕赤酵母中进行表达。整合方式：a、单交换，外源基因通过重组插入到毕赤酵母染色体基因组his4位点或AOX1基因的上游和下游，b、双交换，酵母染色体AOX1基因被载体外源基因表达元件和标记基因所代替，该方法对甲醇的利用率低，但它表达外源基因的效率高。,.,（三）外源基因在毕赤酵母中的表达,1、异源蛋白在酵母中表达的一般步骤A、将编码异源蛋白的DNA序列克隆进含有酵母启动子和转录终止序列的表达框中。B、转化及在宿主中稳定维持此DNA融合产物C、异源蛋白在特定培养条件下合成D、异源蛋白的纯化及其与天然产物的比较,.,2、外源蛋白的表达方式分为胞内表达和分泌到胞外两种胞内表达适于在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白。分泌表达一般为优先原则方式，因为毕赤酵母只分泌很低水平的内源蛋白，外源蛋白的纯化非常简便。,.,3、表达产物的翻译后加工、修饰毕赤酵母可以对蛋白进行翻译后修饰，包括信号肽加工、蛋白折叠、二硫键形成、O-连接和N-连接糖基化修饰、磷酸化修饰等。,.,4、影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素（1）目的基因的特性A、特定的A+T富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致只产生低水平或截短的mRNA。B、外源序列中的mRNA5非编码区的核苷酸序列和长度会影响核糖体40S亚单位识别的障碍。C、某些稀有密码子是制约翻译速率的因素。,.,（2）启动子的影响常用的强启动子有AOX1、GAP、FLD1这些强启动子有时会引起外源蛋白高水平表达，超过宿主细胞翻译后处理加工能力所能承担的最大负荷量，引起蛋白的错误折叠、不加工或错误定位。可选择较温和的启动子，如PPEX8、PYPT1。,.,（3）基因剂量有些单拷贝的表达盒就可得到较理想的表达产量，有些提高拷贝数可大大增加表达水平，还有些增加拷贝数反而降低了表达水平。因此，高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准，基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。,.,（4）宿主、整合方式及转化子的类型AOX1位点的双交换，可产生表型为Muts（甲醇利用慢）的菌落，单交换引起的基因插入，菌落表型为Mut+。一般情况下，胞内表达最好选择Muts，分泌表达，应尽量选用表型Mut+。但是，对整合位点、整合方式、转化子表型的选择应根据外源基因的特点和研究目的设计合理的技术路线。,.,（5）影响蛋白质稳定性的因素蛋白酶是一个重要因素。提高外源目的蛋白稳定性的方法：降低培养基的pH和培养温度，破坏蛋白酶作用的最适条件培养基中添加蛋白胨和酵母提取物以增加蛋白酶作用的底物选用蛋白酶缺陷型菌株做宿主菌进行表达,.,（6）发酵条件的影响通气量碳源，常用甘油做碳源，但是碳源会抑制AOX启动子。一般采用甘油培养基使细胞达到一定浓度，再加甲醇诱导的，两步法来表达外源蛋白。诱导时间起始pH添加特殊的营养物质,.,三、昆虫杆状病毒表达系统,核型多角体病毒的多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因。1、其缺失对病毒复制增殖毫无影响，可以作为外源基因理想的插入位点。2、多角体蛋白被外源基因取代后，不形成多角体，在显微镜下可以与野生型相区别。,.,（一）杆状病毒表达系统的原理首先建立一个转移载体质粒，在这个转移载体上含有多角体蛋白基因的启动子及多角体蛋白基因的旁侧序列；然后将外源基因克隆至转移载体的多接头的合适酶切位点处，使其处于多角蛋白基因启动子的控制之下；再将重组转移载体与野生型病毒DNA一起共转染昆虫细胞，外源基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。最后利用空斑形态形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染宿主细胞或幼虫，即可获得大量的外源基因表达产物。,.,（二）杆状病毒表达系统的特点1、重组蛋白具有完整的生物学功能2、能进行翻译后的加工修饰3、表达水平高4、能容纳大分子的插入片段5、能同时表达多个基因6、适合表达细胞毒性蛋白7、安全,.,不足之处：1、非连续性表达。重组杆状病毒能导致宿主死亡，所以每一轮外源蛋白的表达必须重新感染新鲜的培养细胞或宿主2、其表达产物的糖基化相对简单，多不分支，糖侧链甘露糖成分高，缺乏符合寡糖。,.,三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达,.,1哺乳动物细胞表达体系的优点,哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化