【生物技术在油菜种质创新中的应用】华质泰科生物技术(北京)有限公司

【生物技术在油菜种质创新中的应用】华质泰科生物技术(北京)有限公司 摘 要：从胚拯救、体细胞杂交、体细胞无性系变异和基因工程4方面综述了现代生物技术在油菜种质创新中所取得的成绩。胚挽救技术主要用于克服远缘杂交受精后的不亲和，提高获得杂种的频率；体细胞杂交由于绕过有性杂交不亲和障碍，扩大了杂交范围；基因工程技术借助分子操作技术，达到定向改变目标生物遗传物质的目的，拓宽其种质资源。另外，对限制生物技术在油莱种质创新中的一些因素和其发展前景进行了讨论。 关键词：生物技术，油菜，种质创新 ：S56540353 ：A ：10077847(xx)01001806 种质是决定生物遗传性状，并将遗传信息从 亲代传递给子代的遗传物质，含有种质并能繁殖 的生物体即为种质资源。种质资源是人类赖以存 在和发展的基础，它的保存和创新将直接关系到 人类的未来，油菜是世界范围内广泛种植的油料 作物之一，是世界食用植物油和植物蛋白的主要 之一，对人们的生活起着举足轻重的作用。 然而，目前我国广泛种植的甘蓝型油菜引自欧洲， 其遗传背景比芸薹属其他物种狭窄，育种和生产 中遗传基础单一的问题十分突出，因此利用现代 生物技术拓宽其遗传基础，扩大其种质资源具有 重要的理论和实际意义。本文主要就胚挽救技 术、原生质融合技术、体细胞无性系变异和基因工 程技术在油菜种质创新中的应用现状作一综述。 1 胚挽救技术与远缘杂交 1.1 远缘杂交 远缘杂交具有能创造新的作物类型、能利用 异属和异种的特殊有利性状、能丰富作物的变异 类型、创造新的雄性不育源、探索研究生物进化等 重要意义。因此，远缘杂交在油菜遗传育种中被 广泛应用，运用传统育种方法进行远缘杂交育种 常常受到有性不亲和性的限制，其主要表现为杂 交后胚不能形成或者胚的发育受阻，从而导致幼 胚易天亡，因此，一般的人工杂交较难成功，只有 极少数在不经胚拯救条件下能获得杂交种。 12 胚挽救技术 胚挽救技术是指在受精完成后易发生胚败育 的杂种胚，在其停止发育前将其与母体分离，进行 人工培养而获得杂种植株的技术。根据其外植体 的不同，胚挽救技术包括子房培养、胚珠培养和胚 培养。现在由于试验条件的限制以及远缘杂交胚 比正常胚弱小等原因，很难从子房中直接剥离出 幼胚进行胚培养，并且子房培养与胚珠培养和胚 培养相比，实验操作较为简便，而且能够获得比较 满意的结果，因此子房培养被广泛应用于油菜的 育种实践和遗传研究，3种外植体培养方法目前 不仅是克服油菜远缘杂交不亲和性的主要技术， 同时也是克服芸苔属植物受精后杂种胚败育，提 高杂种结实率的有效办法。当然胚挽救的成功与 否常常与外植体的离体时期和基因型有密切的关 系，早期的育种工作由于受到不亲和性和胚败育 的限制而使许多远缘杂交工作无法开展。胚挽救 技术不仅能在一定程度上克服远缘杂交中的不亲 和性，也使过去人工杂交难于获得杂种的远缘杂 交，获得了杂种，而且极大地提高了获得远缘杂种 频率。此外，它使获得的远缘杂种Fl代能通过无 性繁殖方式保存下来，这为开发利用植物遗传资 源，如培育油菜新品种(系)和新类型，开辟了一条 新途径，从而使油菜与其近缘种、属间的远缘杂交 的研究进程不断得以深入。目前，借助胚挽救技术 已经成功地获得了许多远缘杂交种(表1)，众多的 实例表明，胚挽救技术作为一种育种辅助手段能 够有效地促进远缘杂交种等新种质的获得和保存 。目前，胚挽救技术与传统杂交方式相结合已经成 为远缘杂交进而获得远缘杂种的有效途径之一。 2 体细胞杂交 体细胞杂交又称原生质体融合，是指两种原 生质体间的杂交。它不是雌雄配子间的结合，而 是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合。因 此，杂交的产物异型核细胞或异体核中将包 含有双亲体细胞中染色体的总和及全部细胞质 当然，由于自然的原因，由杂种细胞再生成的杂种 植株内，染色体数目和细胞器的组成以及其他细 胞质成分还有不同程度的变化，或者由于人为的 控制(如人工诱变)，也会使杂种细胞内的遗传物 质发生变化，从而大大增加了后代的变异，理论 上体细胞杂交可在包括种内、种间、属间、科间甚 至界间的任何原生质体间进行。它能克服有性远 缘杂交育种中的不亲和性，从而获得亲缘关系很 远的体细胞杂种。 油菜的原生质体融合技术始于20世纪70年 代。通过拟南芥菜和白菜型油菜原生质体融合获 得了自然界不存在的属间体细胞杂种拟南芥 油菜。自20世纪70年代得到萝卜胞质三系后，近年 来，各国科学家广泛开展了原生质融合技术的研 究。目前，体细胞杂交技术不仅被广泛用于油菜的 细胞质雄性不育研究，而且也应用于油菜的抗病、 抗虫、抗逆境等方面的研究。Sikdar采用原生质 体融合技术获得了芝麻菜(Esativa)与芥菜型油 菜(B.juncea)的属间体细胞杂种。Faleson采用 原生质体融合技术，将甘蓝型油菜的下胚轴原生 质体与芝麻菜(Esativa)的叶肉原生质体融合，获 得杂种细胞，这些杂种细胞再生形成23个杂种植 株。MSkarzhinskaya et，al利用Bnapus与 LesquereUa fendleri进行体细胞的对称与不对称 融合，均得到了属间体细胞杂种。胡琼等用甘 蓝型油菜(且napus)与诸葛菜、野生油菜进行 体细胞杂交得到了甘蓝型油菜的雄性不育材料。 3 体细胞无性系变异 不经体外选择而在组织培养植株上发生的变 异称为体细胞无性系变异(somaclonalvariation)。 由于组织培养改变了细胞分裂的正常周期，使异 染色质DNA复制更加延迟，从而使带有异染色质 区的染色体在细胞分裂过程中发生断裂、引起染 色体畸变，诱发转座因子，因此，在组织培养条件 下得到的再生植株存在着丰富的遗传变异。这些 变异也许是一种原然界不存在的可遗传变 异，可被用于作物的改良。另外，由于组织培养的 环境条件可以严格地加以控制，我们就可以模拟 出各种自然灾害条件，如培养基中NaCl的浓度、 pH值、添加对某些作物危害最大的流行病菌毒素 或者最有效的除诱剂等，组成各种特异性选择培 养基，从而筛选出具有对特殊自然灾害抗性、抗药 性或抗病性细胞系或再生株，为作物遗传改良提 供宝贵的种质资源。 乙酰甲基磺酸(EMS)种子诱变结合根弯曲突 变体筛选法是目前应用较普遍的耐营养胁迫突变 体筛选方法。吴沿友等用呼吸代谢EMP途径 的抑制剂碘乙酸钠，筛选出经EMS诱变处理 的油菜幼胚培养苗的抗碘乙酸钠突变体，其产量 和含油量分别比对照提高，油分品质提高，耐菌核 病能力增强，成熟期提早。 尽管利用体细胞无性系变异仍存在着细胞和 植株水平变异不一致等局限性，但是其作为一条 安全而有效的创造新种质途径仍有着广泛的潜在 利用价值。 4 植物基因工程技术 基因工程即重组DNA技术，它不是通过一般 传统的有性杂交方法，而是按照预先设计的蓝图， 借助于分子操作技术，将某种生物的基因或基因 组转移到另一种生物中，使后者定向地获得新的 遗传性状，成为新的类型。与传统的有性杂交相 比，转基因技术有如下两方面的显著特点：1)目的 基因明确，性状改造预见性强；2)育种年限显 著缩短。转基因技术转移的仅仅是目的基因本身 及相关的选择标记，不涉及庞大的遗传背景，对转 基因植株经过12代自交即可获得纯合的转基 因品系，目前在油菜种质创新中，利用基因工程 技术可以改良其蛋白质成分，提高必需的氨基酸 含量，改变脂肪酸组成，培育抗病毒、抗虫等新品 种，从而增加油菜的种质资源。 4.1 获得品质改良的转基因油菜 通常情况下，油菜种子的油脂和蛋白质含量 分别为40和20，Stoatiesdijk等利用农杆菌 介导转化油酸减饱和共抑制结构基因，获得了种 子油酸含量分别高达89、73转基因甘蓝型油 菜和芥菜型油菜。陈锦清等从光合产物分配 角度，利用反义PEP基因技术创制超油油菜新种 质，成功地选育了转基因油菜超油1号和超油2 号，其含油量分别高达4784和527，Vesna 等将拟南芥(Arabidopsisthaliana)的脂肪酸延 伸酶基因fael导入 _油菜的栽培品种Hero 中，转基因的植株种子芥酸的含量和油脂的产量 均超过对照。石东乔等将反义油酸脱饱和酶基 因(Fad2基因)导入油菜，获得的转基因油菜种子 油酸含量升高，亚油酸、亚麻酸含量降低，其中油 酸最高含量为6872，比对照提高20以一。 42 获得抗除草剂的转基因油菜 将编码除草剂失活酶的Bar基因、Pat基因、 aroA基因(编码5烯醇丙酮酰草酸酶的一种点突 变基因)导人油菜，可获得对除草剂的抗性。Kumar 等利用农杆菌介导的方法将Pat转入油菜，获 得了抗广谱除草剂2氨基4丁酮酸的转基因 植株。目前， _批准的抗除草剂转基因油菜 品种如LG3315、LG3295、N92、GT73、GT200等 已进入商品化生产。美国FAD批准了抗草甘膦、 抗草丁膦等转基因油菜进入商品化生产。 4.3 获得抗病转基因油菜 病毒病和真菌病是制约油菜生产的两大病害， “双低”油菜品种，对真菌病害更加敏感。采用传统 的育种方法选育到真正抗真菌病的新品种比较困 难，因此，通过转基因技术得到的抗病毒病、真菌病 的新种质具有重要的理论意义和实践价值。 在抗病毒病转基因油菜研究过程中，一般采 用病毒的甲基因和对病毒具广谱抗性的商陆 pap基因。陈军等利用激光微束穿刺法将 TuMV的甲基因导入油菜小孢子中，成功获得了 转基因油菜。张海燕等以油菜子叶柄为材料， 采用激光微束穿刺法，将损伤诱导型启动子控制 之下的pap导入油菜H165中，经庆大霉素筛选， 获得了抗性再生植株，经检测，pap连同损伤诱导 启动子已稳定整合至油菜基因组中，接种TuMV 的攻毒试验表明，80的转基因植株未出现病毒 引起的花叶和叶片皱缩等症状。 利用基因工程手段进行的抗真菌病研究，一 般采用-1，3葡聚糖酶基因及几丁质酶基因，张 丽华等将几丁质酶单基因或几丁质酶和1，3 葡聚糖酶双价基因导入甘蓝型油菜，均获得了 H165抗菌核病材料。 44 获得抗虫转基因油菜 目前主要利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)即9J毒素蛋白基因转移到油菜中， 苏云金芽杆菌的某种杀虫性细菌能够合成某些昆 虫致死的蛋白质，从而获得抗虫的转基因油菜。 官春云等采用农杆菌介导法和子房注射法成 功地将将BT毒素蛋白基因转入甘蓝型油菜品种 湘油13号，选育了遗传稳定的优质抗虫油菜新品 系。该品系对菜青虫有明显的抗虫性，菜青虫存活 率明显降低，不足20，而对照存活率高达70。 此外，菜青虫取食速度降低、成蛹体重减轻，中高 龄幼虫历期延长，品系抗虫优势十分显著，李学宝 等利用农杆菌介导法将抗虫基因cryA导入 油菜，也获得了油菜抗虫转基因植株，并对其抗性 和后代株系进行了分析研究。 45 创造新的油菜雄性不育系、恢复系和保持系 利用常规的育种方法来选育不育系存在周期 长，见效慢，不育基因单一，对环境因素影响敏感 等问题，远不能满足生产发展的需要通过基因 工程创造油菜雄性不育系及其恢复系可以缩短育 种时间。有效地解决常规育种手段的局限性。目 前利用基因工程创造雄性不育系主要是利用花粉 发育的特异启动子与外源基因连在一起，构建成 植物表达载体，转化油菜来阻断花粉的发育从而 达到雄性不育的目的。Mariani等将编码核糖 核酸的基因置于TA29启动子(花药绒毡层特异 表达启动子)控制之下，构成嵌合基因，并使嵌合 基因与Bar基因(抗除草剂PPl)连接一起转化油 菜。TA29在花药绒毡层特异表达，导致花粉败 育。从而获得油菜雄性不育系，恢复系为转核糖核 酸酶抑制剂基因，保持系为非转基因油菜品种，保 持系与不育系杂交后代的分离，可通过除草剂进 行筛选(不育系抗PPT)。 5 转基因油菜新种质的安全性分析 转基因植株的安全性主要包括食品安全性和 环境安全性两方面食品安全性是指人们食用转 基因食品后，尽管其中绝大部分DNA已降解，并 在肠胃中失活，但极小部分是否会有安全性的问 题。转基因所使用的抗生素抗性筛选基因对人体 健康可能造成的不利影响，目前人们认为这些可 能性都比较小，标记基因导致治病时抗生素不起 作用的风险也可以忽略不计。转基因的环境安全 性主要指基因漂流或基因扩散，转基因可能转移 到杂草，产生抗除草剂的超级杂草；或者向其他作 物转移，改变其性状，从而对生态环境和生物多样 性造成潜在的危害性，宋小玲等用3种类型油 菜(Brassica slop)和野芥菜(且扣ncea var gracilis Tsen ecLee)杂交，发现白菜型油菜向野芥菜的基 因漂流可能性最小，甘蓝型居中，而芥菜型极易向 野芥菜发生基因漂流。另外，他还发现抗除草剂基 因油菜的抗性基因向诸葛菜漂移的可能性小。 SIWarwick et al发现从转基因甘蓝型油菜向 蓝花子和野生油菜漂流基因的可能性非常低 (-5)，然而，转基因经过芜菁能够在环 境中扩散利用叶绿体转化可以有效地控制由于 外源基因扩散而引起的生态风险性。在油菜中， 利用叶绿体转化可以控制外源基因的扩散已得到 大田试验的证实。Scott和Wilkinson对叶绿体 转基因油菜保持外源基因的情况下，发现叶绿体 转基因油菜扩散外源基因的可能性非常小。 6 展望 生物技术在油菜种质创新中的应用已展示出 了广阔的前景。现代生物技术将油菜种质创新从 个体、细胞水平提高到了基因水平，可以克服常规 育种的许多局限性，提高育种效率，实现育种新突 破，从而创造出许多自然界不存在的新种质如通 过胚拯