CART的治疗进展和发展趋势-B

.,CAR-T治疗进展和发展趋势,.,2012中国肿瘤登记年报,恶性肿瘤已成为严重威胁生命安全和身体健康的重要杀手。全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升。预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。,.,WHO：2014年中国癌症现状,.,.,细胞免疫治疗,生物治疗是继手术、放疗、化疗之后又一新的肿瘤治疗技术，掀起了肿瘤治疗的绿色革命，有着广阔的发展前景。美国科学杂志公布年度十大科学突破，其中癌症免疫疗法居于首位。免疫细胞治疗是采集患者外周静脉血，在GMP实验室内分离外周血单个核细胞，在多种细胞因子诱导下，大量扩增出具有高效抗瘤活性的免疫效应细胞，再通过静脉、皮内注射、介入等回输到患者体，达到增强患者免疫功能和杀伤肿瘤细胞的目的。,.,免疫细胞治疗的种类,第一代：细胞因子激活的杀伤细胞（LAK），肿瘤侵润淋巴细胞（TIL）。第二代：细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。第三代：树突状抗原呈递细胞(DC)刺激细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）。第四代：利用肿瘤靶向抗体（TCR），或者嵌合抗原受体(CAR)。CAR-T免疫细胞治疗是当前科技当中唯一有可能彻底清除癌细胞的方法。,.,非特异性免疫细胞：LAK，NK，CIK,特异性免疫细胞：TIL,特异性免疫细胞：TCR-T，CAR-T,识别广谱，无特异性，细胞培养易,特异性弱，细胞培养较难,特异性强，需转基因操作,特异性免疫细胞：DC-CIK,特异性弱，细胞培养较易,免疫细胞的种类,.,CAR-T,在临床上发现肿瘤时，一般已是中晚期，此时病人体内肿瘤细胞占优势，严重损害了机体的免疫功能，在这样的免疫系统微环境下，DC细胞功能受损，激活T细胞效率较低，攻击癌细胞能力不够，也不够精准；另外，肿瘤细胞通过低表达或不表达MHC分子的逃逸机制，逃脱免疫细胞的攻击。这就需要制造精密制导、精准打击的免疫细胞武器，克服MHC介导的杀瘤机制。于是，靶向性抗肿瘤细胞CAR-T技术应运而生。近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)的T细胞显示出的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。,.,1989年首次提出和设计通过将识别肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,TAA)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs,ITAM,通常为CD3或FcRI)”在体外进行基因重组,生成重组质粒,再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞,使患者T细胞表达肿瘤抗原受体,转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞,称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。,.,CART19,.,CAR-T技术原理,CAR是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过转染技术，转染经纯化与大规模扩增后的T细胞，称之为CAR-T细胞。CART技术应用范围广泛，针对某种或数种肿瘤相关抗原阳性的肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、食道癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤均可治疗。,.,CAR-T技术发展历程,.,CAR-T细胞杀伤模式,.,免疫治疗：基因测序后的下一个万亿市场,诺华开发的CART-19，已完成临床2期试验。研报认为CART-19产品理论市场规模能够达到80-100亿美元。这仅仅是一家公司的产品所达到的市场规模，并不是整个行业的市场估值。国际上,诺华、罗氏、安进、默克、GSK等公司已进军细胞治疗行业。国内香雪制药，姚记扑克，冠昊生物等公司纷纷投资。,.,积极参与激烈竞争,.,美国小药企收购解放军总医院CAR-T疗法，中国金蛋为何砸到了美国？,2015年2月9日，美国生物制药公司CellularBiomedicine(CBMG)收购了中国解放军总医院(301医院)的CART细胞疗法，这项收购包括CD19、CD20、CD30、以及人表皮生长因子受体(EGFR)重组表达载体等免疫技术，已有的临床I/II期结果、相关专利的所有权、以及生产技术。,.,CAR-T细胞治疗的优势,降低排异反应风险。使用患者自体细胞。治疗更精准。由于CAR-T细胞是应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁。杀瘤范围更广。鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用。多靶向更精准。CAR-T既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，CAR-T细胞作用过程不受MHC的限制。杀瘤效果更持久。新一代CAR结构中加入了促进T细胞增殖与活化的基因序列，能保证T细胞进入体内后可以增殖，CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。低剂量。少量的细胞（1.5105个/公斤体重）的CAR-T可以是病情完全缓解。,.,CAR-T细胞治疗流程,.,载体的选择,质粒；转座子（睡美人系统）；mRNA；病毒（腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒等）,.,睡美人系统,睡美人转座子CAR-T技术比病毒载体具有简便性,价廉性和安全性。和DNase高敏感位点。,睡美人转座子CAR-T技术比病毒载体具有简便性,价廉性和安全性，且高水平CAR基因表达。,.,慢病毒载体,慢病毒载体（Lentiviralvector,LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体能有效感染并整合到分裂和非分裂细胞中,感染效率高。慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。,.,.,CAR-T治疗抗原的选择,.,血液系统恶性肿瘤中可选择的抗原,.,实体瘤中可选择的抗原,.,.,近期报道的CAR-T临床试验结果,2014年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗30例急淋患者，完全缓解率90%（27人）；2014年，报道携有CD28共刺激信号的CAR-T治疗20例急淋患者，完全缓解率60%（12人）；2015年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗14例慢淋患者，反应率57%（8人）2015年，报道携有CD137共刺激信号的CAR-T治疗1例CD19阴性MultipleMyeloma患者，反应率100%（1人）,NEnglJMed371(16):1507-1517.Lancet385(9967):517-528.SciTranslMed7(303):303ra139.NEnglJMed2015;373:1040-1047,.,ClinicalTrials,China:EGFR，HER2，Mesothelin，GPC3，CEA，MUC1Worldwide:EGFRvIII,EGFR,HER2,FRa,Mesothelin,NY-ESO-1,GD2,VEGFR-2,Chinaisthesecondlargestcountrywhichhas24on-goingclinicaltrialsatpresent.ClinicaltrialshavebeenongoinginC.searchresults.,.,本人构建用于301医院的CAR载体,CAR-CD20（淋巴瘤）ClinicalTIdentifier:NCT01828008CAR-CD19两种（白血病，淋巴瘤）ClinicalTIdentifier:NCT01864889CAR-CD33（甲状腺癌，白血病）ClinicalTIdentifier:NCT01864902CAR-CD138两种（骨髓瘤）ClinicalTIdentifier:NCT01886976CAR-HER1(肺癌，胆管癌，胰腺癌等）ClinicalTIdentifier:NCT01869166CAR-HER2（乳腺癌，胃癌等）ClinicalTIdentifier:NCT01935843,.,.,专利情况,一种工程化CD20，CD19（2个），CD33，CD138（2个），HER1，HER2靶向性的NKT细胞制备及应用。专利申请号：201410062069.7，201410425934.X，20140426383.9，201410425490.X，201410424674.4，201410426057.8，201410426060.X，201410426077.5。,.,CAR-T细胞的制备,.,CAR-T基因的表达,M阳参NKTCAR-TH2O,750bp,100bp,2000bp,250bp,.,免疫荧光,CART-V5,.,Feb.2013-Nov.2015：119casesweretreatedin301hospital,.,Objectiveclinicalresponse：6/9(66.7%),FirstreportfromChina:CART19inB-ALL,.,Firstreport:CART-20inDLBCL,本研究结果首次报道了利用CART20治疗进展期DLBCL,.,国际上首次公开报道采用CART-33治疗难治性AML,.,CART138有效解决浆细胞白血病的问题,国际上首次公开报道采用CART-138治疗难治性MM,.,存在的问题,过继性细胞治疗在显示出临床有效性的同时，也表现出一些临床副作用，如何控制这些不良反应，也是过继性细胞治疗所面临的挑战。细胞因子风暴。这是CAR-T技术在临床应用中一个最主要的不良反应，由于T细胞的大量增殖引起的细胞因子释放，引起机体出现发热或发烧，肌痛，低血压，呼吸衰竭等症状。而针对CAR-T细胞回输引起的细胞因子风暴，临床上利用IL-6受体拮抗药物tocilizumab能够缓解。同时有研究小组也观察到细胞因子风暴也与疾病进展程度或者肿瘤负荷有相关性，在高疾病负荷的患者体内，有较高的细胞因子释放。临床表现就是病人超高烧不退，如果不控制好，很有可能就救不过来了。这就是为什么说CAR-T的最后一步是严密监护病人，这其实非常关键。,.,靶向细胞毒性。由于CAR-T抗原的靶向性非常强，无法区分表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，因此针对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，都具有攻击性。如针对CD19的CAR-T细胞治疗，导致B细胞发育不良，靶向Her-2的CAR-T细胞治疗以及靶向MAGE-A3的TCR-T，都能导致肿瘤部位以外的其他组织或器官遭受攻击，如心肺系统毒性。因此选择合适的肿瘤特异性抗原合成的CAR-T，在攻击肿瘤细胞的同时，能够区分正常细胞免受攻击。,.,神经系统毒性。几个研究组在用CAR-T治疗白血病的过程中，观察到少部分患者出现神经错乱，语言障碍，癫痫等神经系统不良反应。其他细胞毒性。如有引起机体自免疫性疾病的风险。,.,未来工作重点：CAR-T的实体瘤治疗,CAR-T细胞疗法对白血病等血液肿瘤取得了巨大的突破，但是从针对实体瘤的临床试验结果看，CAR-T细胞对实体瘤的疗效并不显著。浸润能力不强，需增强CAR-T细胞归巢实体瘤的能力。需克服实体瘤内部微环境对免疫细胞功能的抑制。肿瘤干细胞。可能是癌症患者预后差和难以治愈的关键。安全性。防止脱靶效应。通用性。,.,肿瘤的免疫逃逸,.,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,2A,Caspase9,2A,Caspase9,新CAR慢病毒载体的构建,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,CD27,EF1a,scFv,Hinge,TM,CD3,CD28,CD137,2A,Caspase9,2A,Caspase9,IL-12,IL-12,PD-1,CTLA-4,TGF,.,CD20,CD19,ROR-1,CD133,CD123,CD44V6,HER2,HER1,CAR-T,截至2015年12月,工作整体进度,.,CD30,MESO,LewisY,NY-ESO-1,CEA,EpCAM,MUC-1,EGFRV,CAR-T,截至2015年12月,工作整体进度,.,TK-GCV自杀基因,其机制是干扰DNA合成，