细胞培养基本知识基本技术PPT课件

。1.细胞培养的基础知识和技术。医学院中心实验室。2.主要内容：1 .细胞培养的基础知识。2.细胞生长的条件。3.细胞培养基础技术。3.1.细胞培养。通过机械或消化方法将获得的组织分散成单个细胞。细胞悬浮液由培养基制成。在合适的体外条件下，细胞生长和繁殖，某些结构和功能特征得以保留。培养细胞的特征1-生长模式和类型，附着型，悬浮型，5-培养细胞的特征2-增殖特征，体外培养的细胞不仅保持体内细胞的某些基本特征，而且还具有一些自身的特征。附着-延伸接触抑制-密度抑制增殖。6，附件-扩展，7、接触抑制。当一个细胞被其他细胞包围，导致无处可去并保持接触时，该细胞不再移动，接触区域的细胞膜活动将停止。因此，正常细胞通常不会互相重叠生长。细胞增殖密度受到抑制。当细胞生长合并形成单层时，细胞变得拥挤，然后分裂停止。这种细胞可以在静止状态下存活一段时间，但不会继续分裂和繁殖。转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同之处在于，它们的接触抑制和增殖密度抑制通常降低，因此它们可以增殖至更高的终末细胞密度。培养细胞的特征3-生长过程，单细胞增殖：细胞周期。10、高等生物细胞周期时间长度的变化主要集中在G1期，S期、G2期和M期保持基本稳定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h，11、一组细胞的增殖：细胞生长曲线，接种后，每天进行检测和计数，以细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。测定绝对细胞生长数的常用方法也是测定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。饱和密度：特定条件下培养容器中可达到的最大细胞数。当细胞达到饱和密度时，细胞群停止繁殖。12、潜伏期/滞留期指数生长期平台期/停滞期退化或死亡，13，细胞系生长过程细胞系：原代培养的细胞在第一次传代成功后成为细胞系，这通常可以指可以传代的细胞。细胞株：通过筛选或克隆从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标记的细胞。细胞系亚家族：从某一细胞系中分离出来的细胞系，其特征与原始细胞系不同，称为亚家族。14、有限细胞系：如果传代不能继续或受到限制，则可称为有限细胞系。连续细胞系：能够连续传代的细胞称为“连续细胞系或无限细胞系”。可培养50代以上，可无限期培养。大多数二倍体细胞是有限的细胞系。大多数无限细胞系都发生了突变。嘿。15，原代细胞：从身体获得的组织材料在体外培养和生长，直到第一次传代。继代培养细胞：当原代细胞继续生长和繁殖一段时间并达到一定细胞密度时进行的细胞。16、培养瓶培养方法，方法：将培养物直接接种到培养瓶中，放入培养箱中培养。优点：1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养的影响。2.显微镜观察、染色等操作可以方便地进行，也可以永久保存。3 .增加了培养瓶的培养面积。方法：将培养细胞接种于培养板的孔中，然后在CO2培养箱中培养。少量培养也应称为微培养。悬滴培养法，又称植物块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术。基本要点是：将组织或器官植物块接种在盖玻片上，滴下一滴培养液，然后转动盖玻片，使植物块和营养液挂在盖玻片下，然后放在凹形玻片上，最后用蜡封好，放在培养箱中培养。哈里森用细胞培养解决了一个难题2.在凹面载玻片周围涂上凡士林。将凹面滑块向下压向盖玻片。3.翻转凹面载玻片，用溶解的蜡涂抹盖玻片。将它们放入培养箱中进行培养，-Carrel和早期的组织培养卡氏烧瓶培养法，Earle，Dulbecco等人于1943年22日建立了单层细胞培养法，并首次建立了长期传代的L细胞系。1951年，葛伊首次建立了人类肿瘤细胞系Hela。自20世纪50年代末以来，组织培养技术的应用进入了一个蓬勃发展的阶段，并广泛应用于生物学和医学研究的各个领域。无血清培养基：是一种合成培养基，无需添加血清即可在体外长时间维持细胞的生长和繁殖。然而，它们可能含有单独的蛋白质或大量的蛋白质成分。基本成分是基本培养基和添加成分。为了观察一种生长因子对某个细胞的影响，有必要消除其他生长因子的干扰。血清可能含有各种生长因子。另一个例子是在培养过程中需要测量某些细胞分泌某些物质(抗体、生长因子)的能力。或者需要某些细胞的大规模培养来获得它们的分泌产物。它们通常目标明确，价格高。三维细胞培养技术在体外共培养具有三维结构的不同材料的载体和各种类型的细胞，使细胞能够在载体的三维空间结构中迁移生长，形成三维细胞-载体复合体。普通的细胞培养由于细胞在体外环境中的增殖而逐渐失去其原有的特性，这通常与体内情况不一致，而动物实验完全在体内进行。然而，由于体内各种因素的限制以及体内与外部环境的相互作用，很难研究单一过程和中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养和动物实验之间的技术。它不仅能最大限度地模拟内部环境，而且显示出细胞培养直观、条件可控的优点。应用：软骨和骨组织(软骨细胞和干细胞，再生和受损的软骨和骨)，循环系统和心脏(有目的地改变血管生成)。嘿。26、目前常用的三维培养模型：基质覆盖培养、旋转瓶培养、微载体培养、预设支架培养、旋转细胞培养系统、自发细胞聚集。27、细胞培养技术的特点和应用，优点：1)研究条件可以人为控制；2)研究样本一致；3)研究内容便于观察、检测和记录；4)研究成本与经济劣势相关：体外培养的细胞不能完全等同于体内细胞。28，应用，病毒学：病毒鉴定，病毒抗原效应，疫苗生产.免疫学：杂交瘤-单克隆抗体.遗传学：染色体分析.肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物.分化与发育：改变细胞群体的刺激.细胞毒性实验：功效测试.临床医学与生物技术：干细胞培养定向诱导分化后的移植；组织工程软骨损伤的修复；试管婴儿.嘿。29，营养需求，环境要求，无毒无污染，2，细胞生长条件，30，1，细胞营养需求，(1)完整培养基的组成，如氨基酸，维生素，碳水化合物，无机离子，(2)生长促进因子：基础培养基80%-95%血清5%-20%碳酸氢钠2.0g/L青色，链霉素100单位/ml，31，基础培养基的选择，参考：(1)用于建立细胞株的培养基应是培养这种细胞株的优选培养基购买手机时，您可以咨询参考资料或咨询。(2)可以试用其他实验室常用的培养基。许多培养基可以适用于多种细胞。(3)用各种培养基培养靶细胞，观察其生长状态，可以通过生长曲线、菌落形成率等指标来判断。根据实验结果选择最佳培养基是最客观的方法，但相对复杂。常用的培养基类型包括RPMI-1640(标准)、DMEM-高糖(标准)、DMEM-低糖(标准)、DMEM-F12等。如果没有进行细胞因子和免疫相关实验，建议不要灭活血清。热处理会增加血清沉淀并影响血清质量。甚至严重影响细胞的生长速度，细胞粘附率下降。血清中的沉淀絮状物：解冻后，血清中的脂蛋白变性，血清中的纤维蛋白，这些絮状物不会影响血清本身的质量。它可以通过以3000rpm离心5分钟来去除，或者在显微镜下不能处理的“小黑点”:在血清热处理后，沉淀物的形成将显著增加。一些沉淀物在显微镜下看起来像“小黑点”，经常被误认为是受污染的血清。正常情况下，这个小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，应立即停止，并更换另一批血清。血清的质量是实验成功的关键。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等。胎牛血清质量最好。优质血清标准：透明、淡黄色、无沉淀、无细菌、支原体和病毒污染。碳酸氢钠溶液(碱)的浓度为7.5%。其制备方法包括：溶于三重蒸馏水中，过滤灭菌或高压灭菌，分装，将HEPES(分子量238.31)溶液保存在4。一种弱酸，羟乙基哌嗪乙基磺酸，对细胞无毒性，主要作用是：防止培养基的快速酸碱度变化。在开放式培养条件下，当观察细胞时，培养基与5%CO2的环境分离，CO2气体迅速逸出，且酸碱度迅速上升。如果加入HEPES，此时的酸碱度可维持在7.0左右。通常，HEPES是在克隆培养过程中加入的。最终浓度通常为10-50毫摩尔/升，通常制成1M储存溶液：将4.76克HEPES溶于20毫升双蒸水中，过滤、灭菌或高压灭菌，装在小瓶中，在4下储存。使用时，可向100毫升培养液中加入2毫升HEPES浓缩液，最终浓度为20毫升/升。35岁。抗生素的使用：在培养液制备后，通常向培养液中加入适量的抗生素以抑制可能存在的细菌的生长。通常青霉素和链霉素一起使用。最终浓度为每毫升100单位。36、准备1000毫升RPMI1640培养基、10.4克(1包)RPMI 1640干粉培养基、400毫升超纯水，磁力搅拌至完全溶解，加入1000毫升等体积的超纯水，用装有0.22m孔径滤膜的灭菌过滤器灭菌，分装200毫升/瓶，并在-20下储存备用。使用前溶于瓶中，每200毫升培养液中加入灭活小牛血清，直至最终浓度为10%，即加入22毫升。青霉素和链霉素的最终浓度分别为100U/ml。嘿。37、消化液、分离的组织和分散的细胞是常用的：胰蛋白酶和二乙基氨基四乙酸二钠(乙二胺四乙酸)单独或组合使用。38、胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连的肽键，去除细胞间粘蛋白和糖蛋白，影响细胞骨架，从而分离细胞。胰蛋白酶溶液的浓度越高，效果越强，但是超过一定的限度就会损伤细胞。胰蛋白酶溶液的消化时间：2-10分钟。用含血清的培养液停止对细胞的消化。39、将胰蛋白酶粉末放入烧杯中，与少量的D-Hanks平衡盐溶液混合成糊状，然后补充D-Hanks平衡盐溶液(通常浓度为0.25%)并混合均匀，将其置于室温下4小时或冰箱中过夜，连续搅拌并振荡第二天，用滤纸粗滤，然后过滤并灭菌，放入瓶中，在-20下保存以备后用(以避免分解失败)。胰蛋白酶溶液是偏酸的。使用前，可用碳酸氢钠溶液将酸碱度调至约7.2。制备胰蛋白酶溶液。40，乙二胺四乙酸四钠溶液是一种化学螯合剂，对细胞有一定的分散作用，毒性小，价格低廉，使用方便。常用工作液的浓度为0.02%。注意：细胞用乙二胺四乙酸处理后，应该用平衡盐溶液清洗干净，因为残留的乙二胺四乙酸会影响细胞生长。41，D-汉克斯平衡盐溶液(D-汉克斯平衡盐溶液，D-HBSS)。42，2。环境要求要求细胞培养必须具有物理和化学性质在达到最佳温度(37)之前，一般细胞繁殖速率随着温度的升高而增加，但是当温度逐渐升高并超过最佳温度时，繁殖将被抑制。当温度为25-35时，细胞的生长速度非常慢，但它们能存活。细胞可以在4时存活几天。只要温度不低于0，细胞就能存活。加入保护剂后，它还可以储存在液氮中。当在41-42中高温培养1小时时，细胞受到严重损伤，如果温度高于43，大多数细胞将死亡。高温对细胞的影响比低温更明显。44、气相和酸碱度，5% CO2，95%空气混合气体(O2)。CO2不仅是细胞生长所必需的，也是细胞代谢的产物，并且与维持培养基的酸碱度有关。最佳的酸碱值7.2-7.4低于或高于6.8，这可能对细胞有害，甚至死亡。酚红指示器：黄色6.6橙色8.0红色，45，3，无毒无污染，无毒：无毒是细胞培养的必要条件。任何与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。如果它具有细胞毒性，细胞就容易死亡。因此，在选择器皿和材料时必须小心。体外培养的细胞缺乏人体免疫系统，没有防御能力。一旦细菌和其他污染发生，细胞最终会死亡。交叉污染往往会导致细胞系失去其原有的特性。细胞培养的基本技术，1。原代细胞培养，2。亚文化，3。培养细胞生长的观察。冷冻保存、回收、运输和48。无菌操作中的注意事项。无菌操作时，无菌实验室和无菌手术台必须用紫外线灯照射30分钟，用75%或70%的乙醇擦拭无菌手术台，无菌手术台风扇应打开10分钟，以免污染。不要触摸吸管尖端或容器口，也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手握住瓶盖，握住瓶体。当以大约45度的角度拿取容器时，注意细菌意识和无菌操作。原代细胞培养原理：从动物体内取出各种组织，用各种酶(常用胶原酶)或组织贴壁法进行处理，获得单个细胞或细胞群，在合适的培养基中培养，使细胞存活、生长和繁殖。仪器、材料和试剂：CO2培养箱、培养瓶、平板、烧杯、吸管、移液枪、手术器械、计数板、离心机、水浴箱(37)、1640/DMEMF12培养基(含10%血清)、2%胶原酶II、PBS、酒精，50，组织消化法，1。准备：取各种无菌培养物，放在清洗台上，紫外线消毒30分钟。开始工作前，洗手并用75%酒精擦拭手肘。2.组织处理：采集的标本必须在4小时内完成。取出6-10厘米长的脐带，放入烧杯或平板中，用PBS溶液冲洗2-3次，去除血迹；如果怀疑组织可能被污染，可将其放入含有链霉素的混合溶液中30-60分钟。剪切：用外科剪刀将组织切成23立方毫米，然后用眼科剪刀将组织切成1立方毫米的小块，以利于消化。加入占组织总量1: 1的2%胶原酶，然后一起倒入瓶中，密封。4.消化：使用恒温水浴或将其置于37的培养箱中进行消化。在消化过程中，应该每20分钟摇动一次。例如，最好使用电磁恒温搅拌器进行消化。消化时间取决于组织块的大小和组织的硬度。空气振动筛在37下100