CFX96 实时荧光定量PCR培训教材ppt课件

实时荧光定量PCR原理与应用,GeneExpressionDivisionChinaMarketingBio-RadLaboratories,提纲,PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用,PCR目的及背景,多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称技术，是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝.分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。技术实际上是在模板，引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（extension），反应过程见图。,传统PCR,传统PCR,传统PCR,通过凝胶电泳对终产物进行定性分析(30cycles),传统PCR,Theoreticalincrease,LogTargetDNA,Cycle#,Intheory,PCRreactionsamplifyexponentially,doublingeverycycleandgrowforever.Inreality,PCR:理论vs.实际,100倍稀释,普通PCR分析终产物特点,提纲,PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用,定量PCR,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,5,模板,Cycle1,5,2X模板,4X模板,30-40循环,Cycle2,5,5,荧光检测,F,F,F,F,F,F,F,F,荧光监测化学物质,LogView,LinearView,本底期、指数扩增期、平台期,荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数,荧光阈值与Ct值,定量PCR分析初始模板特点,108,标准曲线,106,108,标准曲线,104,108,106,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,标准曲线,108,106,102,104,标准曲线,105copies/well,标准曲线,Ct值特性,ProductT=(Template0)2n(n=#ofcycles),ProductT=(Template0)23.32=(Template0)10,定量PCR优点,定量：对初始模板的绝对定量优点：更灵敏，宽广的动力学范围污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定性灵活：既可多点测定，又可单点测定,提纲,PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用,非特异性标记SYBRGreenIEvaGreen,荧光化学物质,特异性的荧光探针TaqMan分子信标(Molecularbeacons),SYBRGreenI,SYBRGreenI,SYBRGreenI,SYBRGreenI,SYBRGreenI,使用方便，只需要一对引物不必设计复杂的荧光探针熔解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体便宜灵敏无模板特异性不能分辨非特异产物不能做复合PCR扩增,融解曲线反应程序,1、融解曲线在定量PCR反应完成之后,2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱,融解曲线分析-原始图谱,融解曲线分析-导数图谱,EvaGreen饱和荧光染料,非饱和双链DNA荧光染料：e.g.SYBRGreenI,饱和双链DNA荧光染料：e.g.EvaGreen,SaturationDyes,Dyesaturationleavesnoroomforrelocationeventsduringmelting,饱和染料特点,饱和型的专用DNA染料高浓度不抑制PCR反应当双链DNA局部解链时，游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去,荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况,EvaGreenMixBio-Rad,PCR抑制作用,Source:Barrettetal.,QuantaceLtd.,染料重新分配,Source:Barrettetal.,QuantaceLtd.,高分辨溶解曲线,HighResolutionMelt(HRM)ChemistryDNAbindingdyes-LCgreen,EvaGreenandSyto9(DNA饱和染料，低抑制作用)HardwareAbletoresolve0.1oCincrements（仪器在融解过程中更密集地收集数据）SoftwareAlgorithmabletoseparatesmalldifferenceinTm（分析算法可以分辨Tm值的微小差异）,JustimportCFXMeltData,AutomaticselectionofPre-andPost-Meltregions,Normalizecurves,Justchecknormalizedplotsandapplytemperatureshift,Automaticallydetectsclusters,PrecisionMelt-Genotyping,Homozygous-CC,Homozygous-TT,Heterozygous-CT,SsoFastEvaGreen&SNPGenotyping,GAMutation()G:GWild-type()A:AHomozygousMutant()G:AHeterozygous,DiscriminationofaClass2SNP,MethylationStudiesCGU(Taipei),Temperatureshifted,Differencecurve,TAQMAN探针,TAQMAN探针,TAQMAN探针,TAQMAN探针,TAQMAN探针,对目标序列有很高的特异性-特别适合于SNP检测可以在一个反应中进行两个基因的定量荧光强度与反应物成正比反应成本较高设计复杂,TaqMan探针小结,提纲,PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用,定量PCR应用I-实时定量,病原体定量检测转基因拷贝数的检测,DNA定量拷贝数研究（替代SouthernBlot）,RNA定量基因表达差异（替代NorthernBlot),单个或多个基因地表达谱分析不同组织、器官不同时期不同处理,定量PCR应用II：