分子病理学常用研究技术原理及应用PPT课件

.,1,分子病理学常用研究方法原理及选择,.,2,实验方法在科研工作中的意义,决定本项研究的意义与水平：高水平假说+高精尖手段高水平的研究高水平假说+一般手段高水平的研究低水平假说+高精尖手段一般水平的研究低水平假说+一般手段低水平的研究,FromProf.XWBian,.,3,工欲善其事必先利其器,立题的先进性,手段的先进性,科研水平先进性,.,4,选择实验方法的基本原则,必要性,可行性,为什么要选择这个方法,替代方法,经费,实验室条件,时间,基于硬件条件，选择最具有说服力的方法,.,5,1为没有工作经验的医学研究生编写一本适合自学的手册式教材，为他们做课题时更快、更好地选择合适的实验技术提供决策参考。2重点介绍同类实验技术的发展沿革、优劣比较；不同实验技术的特点、用途、相互关系、发展趋势；各类实验技术的关键、操作要点和选择示范。3重点强调医学实验技术的原理与选择，而非具体操作，亦非理论知识。,.,6,常用医学实验动物模型的种类及选择,组织学实验技术,细胞生物学实验技术,分子生物学实验技术,蛋白质化学技术,免疫学实验技术,医学微生物学实验技术,医学实验技术原理及选择,.,7,分子病理学常用实验方法,组织标本取材与固定病理制片切片染色：常规/特殊原位蛋白质检测原位核酸检测,.,8,组织取材,固定,不固定,冻存（不提倡）,冻存,包埋,冰冻切片,HE染色特殊染色IHCISH电镜,蛋白质、核酸提取,固定,不固定,分子生物学实验,-20保存,IF/IHC/ISH,组织标本一般处理流程,.,9,细胞标本一般处理流程,活细胞,细胞爬片,细胞离心涂片,细胞培养,离心后包埋制片,冻存,细胞悬液,固定,形态学IHCISH,Protein/DNA/RNA,分子生物学,IF、FCM,.,10,细胞取材方法适用范围及优缺点比较,.,11,组织固定,定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内物质尽量接近其生理状态时的形态结构和位置的过程意义：防止自溶防止腐败最大限度保存细胞和组织的抗原性保留特殊成分：糖原、核酸、色素等,.,12,组织固定的方法,蒸汽固定法,浸入法,灌注法,微波固定法,某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质,手术取材组织标本和细胞涂片,仅适用于动物实验,.,13,常用固定剂,醛类固定剂,非醛类固定剂,丙酮及醇类固定剂,双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原对组织穿透力强，收缩性小是最常用固定剂,10%中性福尔马林液,4%多聚甲醛缓冲液,适用于多肽类激素的组织固定常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应,穿透性很强，保存抗原活性较好常用于冰冻切片及细胞涂片固定,2.5%戊二醛（电镜）,.,14,组织病理制片技术,常规组织病理制片,脱水，透明，浸蜡，包埋，切片,.,15,组织病理制片技术,组织芯片,近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术,组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具,科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物,.,16,TissueMicroarray,.,17,组织病理制片技术,显微切割：microdissection,选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中常常遇到却又不易解决的问题,该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术,.,18,细微：微米、纳米级切割原位：所取材料定位清楚同质：所取材料在一定层次上相同结合：与其他实验技术结合,显微切割技术的特点,.,19,显微切割本身不能对样品进行研究，必须同其他实验技术结合，其切割目标完全取决于研究目的,.,20,显微切割的方式,手动直接显微切割,机械辅助显微切割,液压控制显微切割,激光捕获显微切割（lasercapturemicrodessection,LCM）,.,21,全自动组织处理机,石蜡包埋机,.,22,石蜡切片机,震荡切片机,硬组织切片机,冰冻切片机,冰冻切片机,.,23,常用组织切片染色方法,未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率,苏木精伊红染色（HE）,HE染色能非常鲜明地对组织和细胞染色，是最基本、使用最广泛的技术方法，又被称为常规染色。,DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色,伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色,.,24,特殊染色,显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能突出显示感染的霉菌区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可区分胶原纤维和平滑肌显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等,.,25,结缔组织染色,胶原纤维染色,VanGieson氏苦味酸酸性品红染色法（简称V.G法）Masson氏三色染色法Mallory氏三色染色法Pollak氏三色染色法SiriusRed苦味酸法等,分布最广、含量最多的一种纤维,.,26,来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风湿性肉芽肿时Aschoffs巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、慢性阑尾炎、肝硬化。血管壁的胶原纤维染色对病理诊断有重要意义。如良性高血压的小动脉玻璃样变（V.G阳性）；恶性高血压小动脉管型纤维素样坏死（V.G阴性而纤维素染色阳性）；高血压性肾固缩，其小动脉V.G阳性呈红色，而淀粉样物质沉积的小动脉壁V.G染色呈黄色,胶原纤维染色的应用,在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别,.,27,结缔组织染色,网状纤维染色,是网状结缔组织内的一种纤维，纤细而有分支，直径约0.21mm，无弹性，穿行于细胞体之间，共同构成网状支架。HE染色不易辩识，用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故称嗜银纤维,主要分布在淋巴组织、骨髓、扁桃体、胸腺、基底膜、血管（特别是毛细血管）、脾窦、肝窦、肌纤维周围、神经纤维、脂肪细胞周围及肺泡等,.,28,结缔组织染色,网状纤维染色,Perdrau氏法、Foot氏法、氢氧化银液法、Wilder氏氢氧化银液法、James氏法、Naoumemko-Feigin氏法、DelRio-Hortega氏法、Hortega氏法、Bielschowsky氏法、Hamason-Lushbangh氏法、醋酸氨银染色法（汪荣法）和组织块镀银法等,.,29,常用于区别癌和肉瘤：癌巢周围常有网状纤维包裹；用于基底膜染色，鉴别原位癌或原位癌早期浸润。鉴别血管内皮瘤和外皮瘤：血管内皮瘤瘤细胞呈泡巢状，周围被网状纤维包绕；血管外皮瘤瘤细胞间可见较多网状纤维。区别脑肿瘤：脑原发性肉瘤周围有较多网状纤维、脑血管周围肉瘤组织内有较多网状纤维，其它脑肿瘤少见网状纤维,网状纤维染色的应用,.,30,结缔组织染色,弹力纤维染色,弹力纤维（Elasticfiber）广泛分布于身体各处，以肺泡壁、动脉壁和皮肤最为丰富。直径约0.21mm，纤维分支，交织成网，电镜下无周期性横带。对沸水、弱酸和碱有一定抵抗力，但可被胃液、胰液等消化,间苯二酚品红法、醛品红法、地衣红法、Verhoeff氏法、Hart氏法、酸性地衣红姬姆萨法、醛复红阿辛蓝法、碱性蓝B染色法、弹力、胶原纤维的双重组合染色法和显示胶原、网状和弹力纤维的三联法,.,31,弹力纤维增生：原发性或继发性高血压的小动脉、皮肤弹力纤维瘤、老年弹力纤维增生症、心内膜弹力纤维增生症、乳腺癌的弹力纤维增生等。弹力纤维断裂、崩解：老年性肺气肿、主动脉粥样硬化、梅毒性主动脉炎、皮肤环状肉芽肿等。,弹力纤维染色的应用,.,32,肌肉组织染色,A.V.G法、Mallory三色染色法、Gomori多色染色法、Gomori氏改良多色染色法、铁苏木素法、偶氮桃红染色法、横纹肌的组织块染色法、苏木素碱性品红苦味酸法、酸性复红光绿染色法、酸性复红染色法、CV-AF染色法和变色酸2R亮绿染色法等,未分化间叶性肿瘤，如横纹肌肉瘤的来源确定炎症渗出纤维素、弥散性血管内凝血的纤维素染色神经胶质瘤研究,.,33,脂类染色,中性脂肪（甘油三酯）染色,苏丹、苏丹、苏丹黑及油红O,.,34,胆固醇及胆固醇酯染色,硫酸铁铵法、高氯酸萘醌法、醋酸铜脂肪酸染色法、酸性苏木因染色法等,动脉粥样硬化病灶、肿瘤组织坏死灶、细胞内类脂沉积、脂性肾病的肾小管、肾上腺皮质中胆固醇类激素含量增减的测定,.,35,磷脂染色,由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的碱基组成，是细胞膜和细胞内膜性结构的主要组成成分，在大脑、神经组织、骨髓和肝脏等含量较多,常用显示方法有酸性苏木素法和吡啶提取法,神经组织主要由磷脂和糖脂构成，用此法可以显示磷脂，用PAS显示糖脂,.,36,糖原染色,糖原又名肝糖，以大小不等的颗粒贮存于肝细胞及肌细胞浆中，遇碘变褐色，易溶于水机体坏死后，糖原即被破坏，须取新鲜标本并及时固定,碘酸-Schiff氏法（PAS）,能打开多糖类结构的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）或氨羟基（-CHOH-CHNH2-）的碳键，生成醛基化合物，暴露出游离醛基（-CHO）。再与无色品红液作用，生成新的红色或紫红色复合物，即Schiff反应。糖原被染成红色，细胞核呈蓝色,.,37,该方法对含乙二醇基或氨羟基的多糖呈阳性反应急性心肌缺血时心肌糖原消失，饥饿时肝糖原减少，糖尿病时肝、肾、肾曲小管可出现大量糖原,.,38,色素染色,含铁血黄素染色,鉴别组织或细胞中的黄棕色色素性质,黑色素染色,含黑色素的组织切片在HE染色中容易与含铁血黄素、脂褐素等混淆,脂褐素染色,在老年性萎缩和恶液质患者的实质细胞、病毒性肝炎时星形细胞内有脂褐素出现,胆色素染色,化学成分是胆红素和橙色血质，为不含铁的血红蛋白分解产物,钙盐染色,病理性钙化是常见病理变化,.,39,神经组织染色,尼氏体染,缓冲亚甲蓝法（Pischingert法）、混合染色法（焦油紫、硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝法）、Thionine氏硫堇法、甲苯胺蓝法、焦油紫法、培花青法等,尼氏体的存在或消失是神经细胞是否受损的重要指标。脑缺血、脑炎、脊髓前角灰质炎及轴突反应等病变时，神经元受损，尼氏体可溶解消失,.,40,神经轴突染色,轴突有嗜银性，常用银浸镀法、甘氨酸银浸镀法和Holmes氏法染色,周围神经干病变可用此法了解神经纤维破坏程度及范围，如麻风病、维生素B1缺乏症或一些中毒性周围神经疾病等,.,41,神经髓鞘染色,髓鞘（myelin）是包裹在神经轴突外面的节段性管状鞘，是由雪旺氏细胞的胞膜（周围神经纤维）或少突胶质细胞的胞膜（中枢神经纤维）包卷轴突作螺旋状盘绕。髓鞘由鞘磷脂构成，含60%的类脂质和40%的蛋白质,碳酸锂苏木素法、砂罗铬花青法、四氧化锇法、Weil氏铁明矾苏木素法、Weigert铁苏木素法、Kultsohitsky酸性苏木素锇酸法、Luxol氏坚牢蓝甲苯酚紫法和Marchi氏锇酸法等。,.,42,神经胶质细胞染色,氯化金升汞法、PTAH法、Holzer氏磷钼酸结晶紫法、Scharenberg氏法、Rio-Hortega氏法等，均属镀金法，在加入二氯化汞的氯化金溶液中，星形胶质细胞具有嗜金性。神经胶质细胞瘤与脑膜瘤、室管膜瘤等鉴别时往往需要做胶质细胞染色,.,43,核酸及核蛋白染色体染色,Feulgen氏染色,显示DNA的一种常用方法。基本原理是在酸水解下，去除DNA中的嘌呤，暴露出脱氧核糖核酸的醛基，后者再与Schiff氏试剂反应，生成紫红色产物，用显微分光光度计和流式细胞测量计对细胞分别进行静态DNA测量和流式细胞测量,核仁组成区（NORS）蛋白染色,是rRNA的染色体片段，与嗜银酸性非组蛋白有关。rRNA基因直接控制着核糖体和蛋白质的合成。计数细胞内NORS的数量可反映细胞增殖的情况。经典方法是银染法，如PLOTON改良法，镜下NORS位于细胞核内呈黑色的颗粒状,.,44,病理内源性沉着物染色,纤维素染色,甲基紫、MSB和PAS等染色法。炎症渗出性改变、DIC、高血压的小血管壁及一些胶原性疾病的疏松纤维,淀粉样物质染色,刚果红染色法（淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色）和甲基紫染色法（淀粉样物质呈红色或紫红色，细胞核呈蓝色）。可用于辅助诊断全身消耗性疾病、区分淀粉样变性与其他变性、肿瘤的诊断与鉴别等,.,45,病原微生物染色,真菌染色,细菌染色,螺旋体染色,病毒包涵体染色,.,46,.,47,原位蛋白质检测,定位定性定量,免疫组织化学,酶组织化学,immunohistochemistry，IHC,enzymohistochemistry，EHC,.,48,免疫组织化学,以抗原抗体反应为理论基础以化学方法显示抗原抗体反应结果定位、定性或定量检测组织和细胞内特定抗原或抗体,免疫组织化学与免疫细胞化学本质上一致，习惯上共同称为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC），也可称为原位免疫学（insituimmunology）,.,49,.,50,IHC的基本知识,抗原,由抗原分子表面的抗原决定簇（antigenicdeterminant）决定其免疫原性，也是抗原与抗体特异结合的基本单位，也称抗原表位（epitope）,抗体,多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）,单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）,基因工程抗体,.,51,多克隆抗体（polyclonalantibody,pAb）,又叫血清抗体，机体接受抗原主动或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。pAb由多个B细胞克隆针对不同的抗原决定簇而产生，特异性较低，与其他抗原间存在交叉反应，使背景着色较高。各批次间可能存在特异性和亲和性的差别。pAb制备程序简单，易大量获得，成本较低，在一些特异性要求不高的实验中，仍在广泛应用。,.,52,单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）,Milstein&khler，1975原理：抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株在一定条件下融合，形成可长期存活并能分泌抗体的杂交瘤（hybridoma）细胞，将其分离培养后形成单个瘤细胞克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中就含有瘤细胞分泌的抗体，这就是mAbmAb由一个瘤细胞克隆产生，只针对一个抗原决定簇，所有抗体分子在结构上完全一致，具有高度特异性和稳定性,.,53,基因工程抗体,采用DNA重组技术生产的抗体第3代抗体1989年Huse等首次构建抗体基因库，使抗体研究从体内和细胞水平进入到分子水平基因工程抗体包括嵌合抗体、人源性型抗体、完全人源化抗体、单链抗体、双功能抗体、片段抗体等重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或与其它分子融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒等重组技术的出现使抗体改造成为可能，并取代杂交瘤技术，为以抗体为基础的生物药物研发开拓了广阔前景,.,54,抗体标记,Ag-Ab复合物并不可见，必须将抗体加以标记并利用标记物与其他物质的反应，形成可见的发光或显色,能与抗体形成牢固的共价键结合；不影响抗原抗体结合；具有信号放大效应；发光或显色反应要发生在抗原抗体结合原位与周围有较高对比度,.,55,荧光标记物,黄色结晶粉末明亮的黄绿色荧光,FITC,紫红色粉末橙红色荧光,TMRITC,两种标记物颜色对比鲜明，可用于双重标记荧光染色。,.,56,酶标记物,免疫酶组织化学法：用酶蛋白标记抗体。通过免疫反应后追加标记物酶催化底物的组织化学反应，得到具有一定电子密度的有色产物，可用光学及电子显微镜观察。,酶活性高而稳定终产物稳定不扩散酶与抗体结合不影响Ag-Ab特异性反应组织与体液中不存在内源性酶及其底物,.,57,酶标记物,辣根过氧化物酶(HRP),(1)体积小，不会遮盖抗原的结合部位，穿透力强(2)稳定且易获得高纯度酶制品(3)具较高活性及特异性(4)不溶性好，终产物不向周边扩散(5)内源性酶较少，抑制方法较多(6)价格相对较便宜(7)特异性底物是过氧化氢(H202)，可选用不同发色基团（电子供体），使终产物呈不同颜色,HRP+H2O2HRP.H2O2HRP.H2O2+DH2HRP+D+2H2O,DAB是广泛应用的电子供体，产物为棕黄色颗粒，不溶于水和有机溶剂有潜在致癌性,.,58,碱性磷酸酶(AKP),酶标记物,磷酸萘酯H2O萘酚磷酸盐萘酚偶氮染料有色沉淀,分子大（100kDa），穿透力较弱某些组织细胞内含有较高的内源性AKP，干扰染色,不溶于有机溶剂，切片不易褪色呈色反应的敏感性比HRP高2-3倍，显色时间从30min到48h其产物为鲜红色，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记,缺点,优点,.,59,葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）,其他标记物,胶体金和铁蛋白：免疫电镜技术的主要标记物,枣红蛋白与FITC共同用于双重标记,.,60,亲和组织化学标记物,抗体标记,利用具有亲和特性的物质对间的高度亲和性，将酶、荧光等标记物与亲和物质连接，对抗原或其他靶物质进行定位和定量的方法,生物素-亲和素激素-受体植物凝集素-糖类葡萄球菌A-IgGFc片段,.,61,生物素亲和素系统,生物素（biotin）vitaminH亲和素（avidin）卵白素或抗生物素蛋白（antibiotin），由4个相同亚基组成，1分子亲和素可结合4分子生物素二者以非共价键不可逆结合，其亲和力是抗原抗体亲和力的100万倍，是自然界已知结合最紧密的物质对之一,生物素分子量小，1分子抗体可结合约150个生物素不影响抗体与抗原结合，也不影响与之结合的酶活性亲和素可与荧光素、酶等标记物偶联具有敏感性高、特异性强、稳定性好和方便快速等特点以不与内源性生物素结合的链霉亲和素来代替亲和素,.,62,Conjugatedavidin,.,63,常用抗体标记技术比较,.,64,IHC主要染色方法及原理,5S：specificitysensitivitysimplicitysafelysave,直接法间接法PAP法APAAP法ABC法,.,65,直接法（directmethod）,用荧光素或酶标记的特异性抗体，直接与待检组织中的抗原反应，又称一步法,操作简单，特异性高而敏感性低抗体需单独标记，生产成本高最常用于肾活检组织及结缔组织病皮肤活检标本的IgG、IgA、IgM及补体等免疫相关蛋白的检测也用于FCM测定各种细胞表面抗原,.,66,间接法（indirectmethod）,又称夹心法（sandwichmethod），分两步检测抗原或抗体。检测抗原时，先以未标记的特异性抗体（第一抗体）与组织或细胞中的抗原反应，洗去未结合的抗体后，再以酶或荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与第一抗体结合，再显色或荧光检查。,敏感性是直接法的3-5倍，但特异性有所降低最大优点在于不必标记每种第一抗体，只需要标记数量有限的第二抗体，利于商品化生产,.,67,非标记抗体法,抗体与酶或荧光素结合不可避免地会降低抗体与抗原结合能力，并影响标记物本身活性,酶桥法（enzymebridgetechnique）,PAP法（peroxidaseantiperoxidasemethod）,APAAP法,.,68,亲和素-生物素法,亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（avidinbiotin-peroxidasecomplextechnique，ABC）,ABC复合物由亲和素与酶标生物素以一定比例结合而成，亲和素作为桥梁，将ABC复合物与生物素化的抗体结合起来，再由抗体检出抗原,最大优点是敏感性高，背景干净，是目前应用最为广泛的免疫组化方法,.,69,亲和素-生物素法,酶标亲和素生物素技术（labeledavidin-biotintechnique，BA或LAB技术）,用亲和素分子直接与酶分子结合，形成酶亲和素复合物，再与生物素标记的二抗结合，其敏感性较ABC法又有数倍提高。如用链霉亲和素（streptavidin,SA）代替亲和素，又衍生出LsAB法，该法避免了与切片中内源性生物素结合，特异性更高。,.,70,EnVision法,利用线状葡聚糖分子与大量酶结合，再将葡聚糖酶复合物(EnVision复合物)连接到二抗上，形成酶葡聚糖二抗复合物，复合物中酶分子绝对数量远高于其他复合物（可达150个）；同时存在多个第二抗体（15个），增加了该复合物与特异性抗体的结合机会，具高度放大作用。,.,71,催化放大系统（catalyzedsignalamplication,CSA法）,原理是增加了生物素化的酪胺基团分子，通过HRP的催化作用，使酪胺基团分子与抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点，使大量生物素沉积在信号位点上，当再次滴加链霉亲和素HRP复合物时，原始信号得到几何级放大。,.,72,常用IHC方法比较,.,73,IHC主要方法演进示意图,.,74,.,75,酶组织化学技术,酶（enzyme）生物体内催化各种化学反应和新陈代谢的特殊蛋白质,组织细胞内的酶并不直观可见，但酶可催化特定底物产生相应反应产物，通过检测产物即可在酶所在部位获得相应信号。这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应产物信号来显示细胞和组织结构中的各种酶，对其进行定性、定位和定量分析的方法称为酶组织化学技术,1950s广泛应用于病理学，操作复杂，必需新鲜组织以保持酶活性,反应特异性较低，限制了其应用,酶本身为蛋白质，具有抗原性，可用IHC检测,.,76,酶组织化学技术,金属沉淀法,底物经酶分解后，其产物可与大多数金属结合，如金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物，产物呈特定颜色,偶联偶氮法,基本原理是应用特定人工合成底物进行酶促反应，其分解产物再与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素,色素形成法,无色底物经酶促反应，在局部形成色素沉着对酶定位,.,77,酶组织化学技术,碱性磷酸酶,酸性磷酸酶,三磷酸腺苷酶,琥珀酸脱氢酶,过氧化物酶,过氧化氢酶,胆碱乙酰转移酶,常用酶组织染色法检测的酶,.,78,原位核酸检测,核酸分子杂交（nucleicacidmolecularhybridization）是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。原理：核酸间的碱基互补结合，及DNA高温变性低温复性不同来源单链核酸只要彼此间存在互补顺序，就可复性形成杂交体。链间序列互补程度越高，越容易结合形成杂交体结构且更加牢固不易洗脱。,.,79,原位核酸检测,常用技术,原位杂交（ISH）,荧光原位杂交（FISH）,原位PCR,引物介导的原位标记技术（PRINS）,.,80,原位杂交：insituhybridization,1969年由Pardue和John等人在不同的实验室几乎同时建立,应用已知碱基顺序并带有标记物的探针（probe），与待检标本上的核酸特异性结合形成杂交体，再用与标记物相对应的检测系统，在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，用显微镜或电子显微镜进行细胞内定位。,.,81,组织切片预处理,探针制备,最大限度地保持细胞内DNA或RNA的完整性,组织具有良好的通透性,.,82,探针的标记,放射性标记,优点：敏感性和特异性均较高,缺点：有放射污染、成本高、实验周期较长,3H，35S，32P，14C和125I等,非放射性标记,荧光素,优点是耗时短，操作简便，干扰因素少，多用于新鲜或冷冻组织、细胞和染色体的原位检测缺点是探针成本较高，需荧光显微镜观察并及时采图荧光素本身为半抗原，可经抗体检出,.,83,探针的标记,非放射性标记,生物素（biotin）,地高辛（digoxin）,人类和动物组织中均无类似物，特异性极高作为半抗原，地高辛也可由抗地高辛抗体检出已成为目前应用最广泛的非放射性标记物,.,84,杂交,杂交后清洗,杂交体检测,去除非特异信号，减少背景着色，以获得较高信/噪比（signal/noise）,标记探针和待检样品上的靶序列通过碱基互补配对相结合而形成杂交体的过程,放射自显影,荧光显微镜,免疫组织化学技术,.,85,ISH的应用,定位细胞内特异性mRNA的转录，用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位；癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化；基因在染色体上的定位；染色体变化，如数量异常和染色体易位等；间期细胞遗传学研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定,.,86,荧光原位杂交FISH,1986年由Dilla首次建立,用荧光物质标记DNA探针，通过ISH检测靶DNA,FISH常为DNA-DNA杂交,.,87,FISH的探针,重复序列探针（repeatsequenceprobes）位点特异性探针（onelocusspecificidentifierprobe，LSI）染色体探针（Chromosomepaintingprobes）单一序列探针（Singlesequenceprobes）由其它载体携带的小片段DNA探针（smallfragmentsofDNAinsertedinothercarriers）,.,88,将已知碱基序列的特异DNA片段作为探针，标记上不同荧光素，与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交，可在荧光显微镜下直接观察结果,直接法FISH,优点是简单、快速。,缺点是信号较弱，敏感性较低,.,89,间接法FISH,探针常用生物素或地高辛等非荧光素标记杂交后通过亲和连接或免疫反应，带入各种发光物质来检测杂交体的存在对杂交信号有逐级放大作用，从而增加了杂交的敏感性,.,90,FISH的应用,基因进化研究,绘制基因图谱,染色体数量和形态结构异常,肿瘤细胞遗传学研究,