白血病分子生物学分型PPT课件

-,1,白血病分子生物学分型,上海血液学研究所朱勇梅,-,2,白血病分子生物学,白血病的分子机制白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用,-,3,白血病的分子机制,基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：点突变染色体重排基因扩增抑癌基因(tumorsuppressorgenes)：指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。,-,4,白血病的分子机制,-,5,白血病的分子机制,增殖过度分化阻断凋亡受抑,-,6,“二次打击”学说,D.GaryGillilandBestPractice16:409-417,-,7,白血病的分子检测,SouthernblotNorthernblotWesternblotFISHPCR测序芯片,-,8,白血病的分子检测,PCR反应原理,-,9,N=N0 x(1+E)nN：扩增子数量N0：起始模板数量E：扩增效率n：循环数,白血病的分子检测,PCR理论方程,-,10,白血病的分子检测,PCR方法优点快速灵敏特异PCR方法缺点假阳性假阴性,-,11,白血病的分子检测,PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。RQ-PCR：可定量扩增产物。多重PCR：同管扩增多个目的片段。,-,12,白血病的分子检测定量PCR,RQ-PCR（Real-timeQuantitativePCR）荧光标记扩增产物荧光标记引物特异性荧光标记探针TaqMan探针、分子信标、杂交双探针荧光染料直接结合扩增产物SYBRGreenI与DNA双链结合动态监测荧光信号变化,-,13,TaqMan探针法,特异性高多重基因定量成本较高,-,14,SYBRGreenI法,成本低最适合初步筛查熔解曲线功能无法多重检测无模板特异性灵敏度低,-,15,白血病的分子检测定量PCR,-,16,白血病的分子检测定量PCR,CT值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数CT值与起始模板量成反比,-,17,白血病的分子检测定量PCR,RQ-PCR的检测系统：该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实时检测的目的。系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到CT值。该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。,-,18,白血病的分子检测定量PCR,RQ-PCR方法优点：灵敏而特异起点定量闭管化学（污染的风险低）没有PCR后处理（无需走胶，拍照等）高度自动化定性：单数据点测定定量：多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定,-,19,RQ-PCR的操作流程,从细胞或组织中抽提DNA或RNA,用PCR或RT-PCR扩增特异片段,将PCR产物克隆到合适的载体上,纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA,体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品）,构建标准曲线（CTlgcopy）,样品的定量检测,校正样品基因拷贝数,-,20,白血病分子检测的临床应用,白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：补充MIC检查的不足发现新的亚型监测白血病的微小残留病灶（MRD）为研究白血病的发病机制打下基础,-,21,PCR方法检测MRD常用的分子标志,-,22,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22)68%原发性AML，在M2中的阳性率为2040%，在M2b中阳性率为90%少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好,-,23,AML1-阴性ETO+,-,24,AML1-ETO,对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发,-,25,PML-RAR,t(15;17)(q22;q21)98%M3患者继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RAR的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和STAT5b-RAR融合基因临床上，具有PLZF-RAR或STAT5b-RAR融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解,-,26,PML-RAR,APL累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图,-,27,PML-RAR,由于PML基因断裂点不同产生3种不同的PML-RAR异构体约55%的M3患者为L型，40%为S型，5%为V型，且每位患者只表达一种PML-RAR融合蛋白形态学上S型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V型APL患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度低,-,28,L+阴性S+,-,29,PML-RAR,RT-PCR检测PML-RAR是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监测。PML-RAR阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值,-,30,PML-RAR,-,31,CBF-MYH11,inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2CBF-MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子（corebindingfactor,CBF）的转录激活作用而致病具有CBF-MYH11的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义,-,32,CBF-MYH11,CBF-MYH11具有多种变异型，其中最常见的为A型，占80%RT-PCR检测CBF-MYH11进行MRD监测显示，大部分患者在完全缓解时PCR转阴，但仍有小部分长期存活者PCR仍为阳性最新研究采用RQ-PCR检测CBF-MYH11转录本水平来评价M4Eo患者MRD情况，预示复发,-,33,-,34,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34)主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较差此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案,-,35,BCR-ABL（p190）,t(9;22)(q34;q11)1530%成人ALL及35%儿童ALL9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色体断裂点具有异质性此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗,-,36,BCR-ABL（p190）,对于自体或异体移植ALL患者，移植前后BCR-ABL的有无以及BCR-ABL的转录本类型与预后有关,-,37,e1a2+阴性,-,38,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13)56%儿童ALL和3%成人ALL此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无病生存期（DFS）仅6个月，3年DFS为20%，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后核型和E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实,-,39,-,40,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22)25%儿童ALL，是儿童ALL中最常见的分子异常目前为止尚未在T-ALL，AML或NHL中发现t(12;21)，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（2%）此类患者发病年龄小（2岁10岁），WBC计数低（50000/L），免疫表型为前B-ALL此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好,-,41,TEL-AML1,由于12p和21q末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0.05%，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率TEL基因重排是独立预后因素，RT-PCR检测TEL-AML1融合基因能将低危险度与高危险度的ALL患者区分开来。因此早期检测TEL-AML1融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义,-,42,-,43,MLL相关融合基因,累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALL,-,44,MLL相关融合基因,至今，MLL相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用：融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化MLL发生断裂后，缺失锌指结构域的MLL不能与DNA结合，失去其转录活化功能，使受MLL调节的靶基因（HOX基因）表达异常，也影响造血细胞的发育,-,45,MLL-AF4,t(4;11)(q21;q23)t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿ALL中最多见，为5070%，而在儿童和成人中较低，分别为2%和36%此类患者发病年龄低（通常90%CML患者BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常ABL高，可能是BCR对ABL激酶活性调节区的作用所致由于5%CML患者为隐匿性Ph染色体，因此无Ph染色体CML患者还需使用更灵敏的分子检测手段如FISH或RT-PCR检测BCR-ABL融合基因RT-PCR还能区分e1-a2和b2-a2/b3-a2二种BCR-ABL转录本，从而区分ALL患者与CML急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案,-,53,b3a2+b2a2+阴性,-,54,BCR-ABL（p210）,巢式RT-PCR检测BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测。可在患者血液学复发前的624个月骨髓检测就呈阳性。RQ-PCR更能动态观察患者治疗（格列卫，骨髓移植等）后BCR-ABL转录本水平变化情况，反映疗效。,-,55,FIP1L1-PDGFR,del(4)(q12;q12)见于HES和CEL，中位发生频率23%(0-56%)由于断裂点不同以及FIP1L1多种选择性剪切形式，产生了不同的融合蛋白，但研究发现所有的病例必有一种融合蛋白维持读码框架，并保留PDGFR的激酶活性区。FIP1L1-PDGFR融合蛋白具有失调的蛋白酪氨酸激酶活性。,-,56,基因突变,45%AML患者核型正常，预后属中等风险组，但其实这是一组异质性很高的人群，有赖于通过基因突变检测对其分类基因突变分二大类：ClassI突变激活信号转导通路，增加造血前体细胞增殖、存活。如FLT3，RAS，JAK2ClassII突变影响转录因子或转录共激活复合物成员，从而影响细胞分化。如CEBPA，MLL，NPM,-,57,C-KIT基因突变,C-KIT为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和c-KIT）成员之一C-KIT突变可见于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21)的M2患者26/54例(48.1%)M2b患者中检测到C-KIT基因突变57例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未检测到C-KIT基因突变以上结果提示C-KIT突变与M2b密切相关(R=0.94,P0.01),-,58,C-KIT基因突变,C-KIT基因结构,JM,-,59,C-KIT基因突变,KIT突变主要有两种。第一种位于受体胞外部分的8号外显子；第二种位于17号外显子的816编码子。外周血白细胞计数,-,60,C-KIT基因突变,多因素分析显示，KIT突变提示预后不良、生存期缩短。,-,61,FLT3基因突变,Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和c-KIT）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用综合国外各研究报道，FLT3-ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外,-,62,FLT3基因突变,-,63,FLT3基因突变,FLT3基因主要突变类型,-,64,FLT3基因突变,mut-FLT3信号通路,-,65,FLT3基因突变,外周血白细胞计数,-,66,NPM基因突变,Nucleophosmin，为核-浆穿梭蛋白，调控p53-ARF通路见于约50%核型正常的AML患者，而在伴低危/高危核型患者中极少见主要见于M1，M2，M4中，以原发AML为主，而在MDS继发AML和t-AML中少见伴此突变患者WBC计数高NPM突变患者预后较好（CR率高，EFS/OS更长），但NPM突变同时伴FLT3-ITD者预后差，NPM+/FLT3-ITD+预后与NPM-/FLT3-ITD+接近,-,67,NPM基因突变,第12号外显子的插入/缺失。14种突变型，A型最多（近90%），其次D型（近10%）,-,68,MLL-PTD,MLL-partialtandemduplications约90%三体11，近10%核型正常的AML，少部分t-AML发生频率与年龄有关（老年患者中频率较高）与FAB分类关系不大主要类型有e9/e3，e10/e3，e11/e3MLL-PTD突变总是同时伴有MLL野生型等位基因的静默此类患者预后差MLL-PTD可与FLT3-ITD共存,-,69,MLL-PTD,MLL-PTD产生原因是由于Alu重复序列的错配MLL-PTD可导致wt-MLL活性丧失，此外重复的DNA结合结构域可导致高转录激活能力，从而致病MLL-PTD在正常人中也存在，但AML患者中MLL-PTD表达水平比正常人高4log，患者MLL-PTD表达下降水平可反映其预后,-,70,CEBPA基因突变,CCAAT/enhancerbindingproteingene，是髓系多能祖细胞向成熟中性粒细胞分化的关键基因见于约10%左右的核型正常AML主要见于M2，M1突变可导致CEBPA蛋白N端截短，此截短的CEBPA蛋白可抑制野生型CEBPA的DNA结合和转录激活能力突变患者预后较好,-,71,N-RAS基因突变,为RAS基因家族成员之一，染色体定位于1p32.2。具有GTP/GDP结合和GTPase活性，调控正常细胞的生长此基因突变存在于11-30%AML在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，而在t(15;17)中低突变热点位于codon12,13和61伴此突变患者外周血WBC计数低该突变预后意义尚不明,-,72,WT-1基因突变,Wilmstumor1存在于约10%核型正常AML患者中突变主要存在于exon7和exon9突变类型主要是移码突变，其次置换突变突变患者预后差,-,73,NOTCH1基因突变,NOTCH1信号对CLP(commonlymphoidprogenitors)向T细胞定向以及前T细胞受体复合物组装是必须的35-50%T-ALL患者存在此基因突变伴NOTCH1基因突变的成年T-ALL患者预后较差,-,74,NOTCH1基因突变,NOTCH1基因结构,-,75,NOTCH1基因突变,NOTCH1突变患者预后差,-,76,GATA2基因突变,调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力CML急变患者中新发现GATA2基因突变，而CML慢性期、加速期，AML（M1-M7），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，可见GATA2基因突变仅与CML急变相关，是CML疾病进展过程中的获得性突变。总发生率为12.5%（5/40），且均造成CML急粒单变GATA2基因突变与CML患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明,-,77,JAK2基因突变,Januskinase2此基因突变主要见于MPD和MDS，另可存在于部分AML尤M2骨髓增殖性疾病中，JAK2V617F突变在PV中发生率约95%，在IMF中发生率约58%，在ET中的发生率约50%。突变主要为V617F突变去除了JAK2JH2负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势JAK2可成为靶向治疗的靶点,-,78,IKZF1基因,位于7号染色体,转录产物为ikarosC端2个锌指结构介导ikaros家族蛋白的二聚化，N端锌指结构介导ikaros和DNA的结合。Ikaros对正常造血时淋系的分化起关键作用。由于IKZF1基因转录后的选择性剪接导致不同isoform的形成。目前主要有13种已经命名的isoform。IK1，IK2，IK3为长片段的野生型isoform，在正常骨髓,胸腺及胎肝的造血细胞中表达。短片段无DNA结合功能的isoform对野生型isoform有显性负的抑制作用，转入无DNA结合功能的Ikarosisoform的小鼠可发生白血病。,-,79,IKZF1基因,-,80,IKZF1基因,在淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病急变的白血病细胞中检出无DNA结合功能的短片段isoformIkarosisoform在各类白血病患者及正常人中的表达频率,-,81,HOX11基因异常表达,t(10;14)(q24;q11)，t(7;10)(q34;q24)7%的T-ALL易位使HOX11基因受控于TCR和TCR基因调控序列，导致其异常表达另有部分HOX11高表达患者核型正常伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，预后也较其他T-ALL患者要好，完全缓解率为100%，平均无病生存期为46个月，3年无病生存率为75%,-,82,HOX11L2基因异常表达,t(5;14)(q35;q32)20%的儿童T-ALL易位使HOX11L2基因处于CTIP2调控元件的控制下，而CTIP2基因在T淋巴细胞分化时高度表达在随访患者中检测到高水平HOX11L2说明白血病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患者HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个低水平。可见HOX11L2的表达水平可作为MRD检测的标志,-,83,WT-1基因高表达,Wilmstumor1在正常人中低表达是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关,-,84,基因表达异常,BAALC基因最初表达于神经外胚层衍生组织和造血祖细胞中，成熟血细胞中不表达。在保留野生型FLT3等位基因（包括FLT3-ITD杂合突变）的患者中，外周血细胞异常高表达BAALC提示预后不良、生存期缩短。ERG基因属于ETS转录因子家族成员，参与调节细胞增殖、分化和凋亡。在核型正常的青年AML中，外周血ERG基因异常高表达提示预后不良。而且，在伴NPM+/FLT3-ITD-突变的患者中，ERG基因异常高表达可以逆转其良好预后，导致无病生存期缩短。,-,85,基因表达异常,MN1基因克隆于伴平衡易位t(12;22)(p13;q11-12)的AML，与ETV6基因形成融合基因。在核型正常的青年AML中，MN1基因的表达异常与高复发率和较短的生存期相关。EVI1基因异常高表达在核型中危异常的AML中提示预后较差，但需同时排查NPM1、FLT3、CEBPA等基因突变的影响。,-,86,SNP(SingleNucleotidePolymorphism),SNP定义DNA序列的某个位点上存在的单个碱基变化(替代、插入或缺失)，在人群中发生频率超过1%,ATTCCGGGTACTACTATTCCGGATACTACT,SNP,-,87,SNP,SNP的数量和分布,-,88,SNP,rSNP：位于调控区的多态，有可能改变转录因子的结合位点，因而影响基因的表达量cSNP：在基因的编码区，如引起蛋白质重要部位氨基酸的变化，会导致蛋白功能及活性改变iSNP：位于内含子，如果靠近编码区，有可能会影响mRNA的剪接。这种情况并不多见其他SNP：分布在基因组其它部位的SNP。虽然可能与基因功能改变不直接相关，但可以作为标记，用于疾病基因的寻找，群体遗传学的研究等,-,89,SNP的检测,对未知多态的检测直接测序变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)变性高效液相色谱分析(DHPLC)在人群中筛查已知多态大规模SNP分型方法如荧光定量、焦磷酸测序、质谱检测、荧光磁珠等,-,90,SNP的检测直接测序,-,91,SNP的检测直接测序,-,92,SNP的检测质谱检测技术,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF）原理：在激光飞行时间质谱仪中，样品被基质吸附后形成晶体，在激光激发下变成亚稳态的离子，在强电场作用下在真空管中飞行达检测器。离子质量越小，带的负电荷越多，会越快到达检测器，据此可准确区分出分子量相差很小的不同核酸片段。,-,93,SNP的检测质谱检测技术,-,94,SNP的检测质谱检测技术,工作流程,-,95,SNP的检测质谱检测技术,单碱基延伸反应,-,96,SNP的检测质谱检测技术,SEQUENOMMassARRAYTMSystem,-,97,SNP研究的意义,SNPs作为遗传标记通过连锁分析定位疾病基因有些SNP本身就可直接导致疾病SNPs对疾病的早期风险评估、早期诊断、预防和治疗等各方面均具有其特殊应用价值药物基因组学有助于新药设计、药物疗效、毒副作用的探究，是实现个体化用药，选择最佳药物的基本保证进化和群体遗传研究研究相应DNA区段的变异速率和序列间差异，获取丰富进化信息，为人类的起源、进化和人群的迁移提供可靠的遗传学证据,-,98,SNP研究新近展,全基因组SNP作图芯片技术（genome-wideSNP-basedmappingarrays）可在较高分辨率的基础上检测等位基因信息和拷贝数异常。通过肿瘤组织中的信号值与正常组织之间的信号值之比得出受检等位基因在全基因组中的拷贝数变化。Gorletta小组在约10%的核型正常A