人体组织中未被认识的间隙的结构和分布

人体组织中未被认识的间质的结构和分布共聚焦激光显微内镜(pCLE)可在在内镜检查期间提供深度在60 - 70m人体组织的实时组织成像。荧光素注射后肝外胆管的pCLE表现为荧光素填充鼻窦内的网状结构，这还没有解剖学上的联系。在固定前冷冻活检组织保留了这个结构的解剖，表明它是黏膜下的一部分，先前未被重视的充满液体的间质，流入淋巴结，并由一个复杂的厚胶原束网络支撑。这些束由成纤维细胞样细胞间歇性排列在一边，内皮标记物和维曼丁染色显示，尽管在这些束的基质蛋白和周围的液体之间有一个非常不寻常和广泛的无内联界面。我们观察到许多组织中有类似的结构，它们受到间歇性或有节奏的压迫，包括整个胃肠道的粘膜下层和膀胱、真皮层、支气管和动脉周围软组织和筋膜。这些解剖结构在癌症转移、水肿、纤维化和许多或所有组织和器官的机械功能中可能很重要。综上所述，我们描述了一个以前未被认识到的，但广泛的、肉眼可见的、在组织内部和组织之间充满流体的解剖学和组织学概念，一个新颖的扩增和规范的人类间质概念。间质是淋巴的主要来源，也是人体主要的液腔。虽然越来越多的人认识到细胞间质的解剖和组成，但在文献中对更大的组织间和组织内空间的存在、位置和结构的描述却十分模糊。这对于“第三间隙”(间隙流体积聚)和考虑整体组织液流动和体积来说尤其重要，这些还没有得到很好的研究1。体内显微技术的进步为人类识别新的、与功能相关的人体解剖结构提供了可能。例如，最近首次通过薄颅骨制备的活体多光子显微成像，确认了大脑中的淋巴管2。探头型共聚焦激光显微内镜(pCLE)是一种体内成像技术，主要在静脉注射荧光素后，通过内镜实时评估组织结构。我们和其他人发现，肝外胆管和胰管，在固定焦距为60 - 70m的pCLE显示粘膜下“网状模式”(图1 A,B)，由20m宽的暗分支带围绕大的荧光素填充的多边形空间组成3。这些与已知结构没有明显的相关性。虽然内窥镜专家认为这个网络代表毛细血管或淋巴管3，但这两种结构都不能解释暗带和明亮、充满液体的空间的网状结构。我们假设这种模式反映了细胞间间质的扩展。我们对人肝外胆管的pCLE和组织学进行了深入研究，以确定网状结构的微观解剖相关性。我们在此报告存在由厚胶原束组成的复杂晶格所限定的新型间质空间(即淋巴前空间)。当我们将研究扩展到真皮，动脉周围基质，黏膜下层的脏器(胃肠道、膀胱)，肺支气管，肌肉骨骼系统和脂肪组织的筋膜平面，我们观察到类似的结构，因此提出了一种大规模修订的宏观和显微解剖学人类间质概念。结果样本取自12例胰胆外科手术切除胆管的手术标本。在血管结扎和手术标本切除前几分钟，用荧光素灌注血管内，并用pCLE直接原位显影网状组织（图1A，B）。该位点被切除，然后再用体外pCLE再次扫描，证实网状结构和荧光素在切除后仍然完好(数据未显示)。然后将标本植入冷冻切片培养基中，用气溶胶冷冻喷雾迅速冷冻，并重新成像(图1C,D,E)。将连续冷冻切片垂直切割，以面向管腔表面的角度用pCLE观察，每隔5m标记一段，直至达到6070m的深度。我们还在横断面上进行了一系列的组织切片。这些切片在常规荧光显微镜下观察(图1F)，显示网状结构与厚的荧光染色束相关(pCLE显示为暗带)。在最终玻片中这些束之间缺乏荧光是由于冷冻切片制备过程中（风干、固定和洗涤）导致流体从最终玻片流出。用马松三色染色法对平行冷冻切片染色，确认存在胶原带分离开放，以前为液体填充的空间（图1G，左）。这些结构与通常在活检和切除标本中见到的致密胆管黏膜下层共同定位(图1G，右，与左图取自同一患者样本)。这说明先前所描述的黏膜下致密结构是由于组织切除和固定过程中液体流失造成的伪影，导致正常分离的胶原束坍塌粘连。我们观察到，在血管内注射在荧光素后30秒内显现了网状结构，大约与淋巴结显像的时间相同，但晚于血管结构显像的时间4。表明这是由间质液或“前淋巴”积累或形成的一种间质空间。冷冻和固定胆管黏膜下层的免疫染色显示胶原束一侧CD34、D2-40阳性(图1H)。其他淋巴血管内皮标记物（CD31，ERG，LYVE-1）免疫染色阴性，但间充质标记波形蛋白呈一致阳性（数据未显示）。肌上皮标记平滑肌肌动蛋白、干细胞标记CD117和核-连环蛋白染色呈阴性(数据未显示)。图1I是一个概述组织学观察的示意图。超微结构研究(图2A,B)显示，胶原束的一侧由薄的扁平细胞(横断面呈梭形)不对称排列，这些细胞胞质较少，细胞核呈椭圆形。这些是成纤维细胞样的，没有特异性细胞型结构的细胞；特别是，它们没有显示内皮分化的超微结构特征，包括胞饮小泡和棒状小体5。电镜也显示这些细胞没有基底膜，提示它们直接附着在下面的胶原束上，而在给定胶原束的一侧由这些细胞排列，另一侧通常是无排列，直接在空间里暴露于液体中。这些束被二次谐波成像(图2C)很好地显示出来，证实了它们是纤维胶原6。也观察到自体荧光弹性纤维，与相同组织中动脉弹性层有相似外观（图2C插图）和弹性Van Gieson 组织化学染色（图2D）。这种胆管粘膜下层结构的特征性组织学特征（充满液体的空间和由扁平细胞不对称排列的胶原束）在其他组织中很容易被观察到。这种结构也在临床切除的皮肤标本的真皮层中得到验证（图3A），荧光素注射后，pCLE应用于体内皮肤的薄层区域，真皮层的网状结构与胆管的网状结构相同。在多个器官和组织中，包括整个消化道粘膜下层、膀胱、支气管周围组织、筋膜和所有大小的动脉和静脉基质的组织学上可见充满液体的空间和胶原束。（图3B和补充图1）。这些结构似乎是前淋巴空间，通过检查结直肠癌切除标本的粘膜下纹身(图4A)表明，其中黑色色素存在于间质空间内的巨噬细胞(图4B)，以及相关的巨噬细胞引流肠系膜淋巴结(图4C)。在检查正常组织时，这些巨噬细胞在间质空间中不可见，并被假定为由于外来物质的存在而进入间质。此外，对箝闭疝伴梗阻的近端肠小肠切除术标本进行检查时，发现黏膜下胶原束被蛋白性(粉红色)液体(补充图2)扩散开来，其组织学上与淋巴相似。通过对胃(图4D-F, n = 3)和皮肤（图4G-I，n2）T2期浸润性肿瘤的研究，进一步强调了空间的淋巴前性质。T2期对胃的侵犯进入粘膜下层，但没有更深。同样的，T2期对皮肤的侵犯直接进入真皮层，但没有更深。低分化浸润性胃癌的侵袭(图4D)表现为间质空间的扩散，周围仍是完整的胶原束(图4E)；尽管在标本中没有明显的淋巴血管浸润，但有转移到引流的肠系膜淋巴结(图4F)。在上臂的恶性黑色素瘤中，直接侵入真皮层(图4G)，在间质空间也有类似的扩散，胶原束被分离(图4H)；再次，尽管没有明显的淋巴血管浸润，但有转移到引流腋窝淋巴结(图4I)。在这两种情况下，即使在对患者进行了完整的临床和组织学检查后，也没有发现其他病灶或传播途径。讨论我们在此建议对粘膜下层、真皮、筋膜和血管外膜的解剖学概念进行修订，认为它们不是致密的胶原屏障状壁，而是充满液体的间质空间。液体的存在对组织功能和病理具有重要意义。我们的数据比较了快速活组织和冷冻组织与标准方式固定的组织，表明我们描述的空间，由胶原晶格支撑和组织，是可压缩和可膨胀的，因此可以作为减震器。我们检测到这种结构的所有器官都受到压缩和膨胀的循环，无论是相对恒定的(肺、主动脉)还是间歇性的(饭后的消化道、排尿时的膀胱、机械压迫下的皮肤、肌肉骨骼系统作用时的筋膜)。真皮间质和筋膜间质在解释水肿方面可能具有机械学上的重要性(如补充图2中预先阻塞的肠道)。术后淋巴水肿(如摘除引流淋巴结时)和肝、肾或心力衰竭引起的全身水肿的“第三间距”可能反映了间质空间的液体扩张和停滞。胆道系统黏膜下的间质空间-贯穿于肝外、肝门间质的整个范围-可以解释急性大胆管梗阻中迅速发展的特征性导管水肿。我们观察到的组织学与体内结构之间的关系的进一步支持来自于组织的超声检查。胆管内镜超声显示，胆管由三层组成，中间一层占壁厚的90%，充满液体7；相当于粘膜下间质。其他脏器、真皮和筋膜的粘膜下空间，通过超声表现为异质性，典型的显示为液体或脂肪组织，而真正致密的胶原基质，如肌腱和韧带，通过超声表现为黑色8-11。我们在皮肤、阑尾和主动脉外膜的超微结构研究中发现了额外的证据支持，它们似乎也包含了这些结构，尽管它们没有很好的特征12-14。在肝脏中，先前在门静脉区发现的“商场空间”可能代表了这种间质15。事实上，商场的原始图画，来源于注射研究，似乎代表了我们在这里确定的相同结构16。排列细胞的性质尚不清楚。虽然CD34和D2-40在肝外胆管细胞均着色，但在所有其他检查的组织中均未见D2-40着色。血管内皮细胞也共同表达CD34和波形蛋白，但电子显微镜下内皮特征的缺失排除了我们观察到的间质排列细胞的分类，这表明它们是一种新的、CD34阳性的成纤维细胞或甚至间充质干细胞17。它们是否是储存胶原束的细胞是未知的；如果储存，它们对伤口愈合中的疤痕形成很重要。值得注意的是，瘢痕表现为胶原束和巨大的空间，这似乎是对真皮层下面这些结构的夸大18。最近的数据显示瘢痕瘤出现在皮肤的高张力区域，因此提出了关于机械力和流体流动对这个空间的结构和细胞的影响的问题19。我们所描述的粘膜下间质可能与研究转移细胞群的间质空间相对应20。消化道和尿路粘膜下通道网络的存在，可以解释一旦到达粘膜下层，腔道浸润性肿瘤发生转移的可能性大大增加。如我们所显示的侵袭性黑色素瘤和胃癌的病例（图4D-I），黏膜下/真皮充满液体通道的存在也表明T1期转移到T2期风险显著增加的原因-因为内脏粘膜下层和真皮是开放的，充满液体的空间，而不是一堵致密的结缔组织墙，所以侵袭性肿瘤细胞很容易通过。此外，这些空间上的机械压力(消化道的蠕动、皮肤的压缩和/或运动相关压力)可以进一步促进肿瘤细胞在这些空间的传播。如果间质排列细胞是肌成纤维细胞的前体，它们也可能在胰胆管树、管状消化道、支气管树、膀胱和皮肤的肿瘤周围硬化中起第一反应。的确，已经报道了一种独特的CD34/波形蛋白共表达的癌周的成纤维细胞21。这些细胞也可以在良性硬化条件下发挥重要作用，包括胆汁闭锁和原发性硬化性胆管炎，真皮和食管硬皮病，消化道炎症性肠病。正在进行的研究集中在描述这些细胞及其功能。间质流体在腔道粘膜下空间GI通道的流动很可能受到蠕动的引导，平行于腔内容物。如果肠腔和粘膜下腔之间存在通信，这就增加了细胞信号(包括激素或免疫信号)可以通过蠕动速度决定的近端到远端调控的可能性。间质空间中的免疫相互作用在炎症性疾病中也很重要，如原发性硬化性胆管炎、慢性胰腺炎、炎症性肠病和硬皮病。有趣的是，虽然在检查的正常组织中未见巨噬细胞，但在黏膜下注射后，它们明显地进入该空间，吸收纹身色素(图4A-C)。间质空间中细胞只排列在胶原束的一侧，这意味着另一侧的胶原蛋白基质与间质流体直接接触。在人体中，除了细胞间质空间、肾小球和窦周隙之外，几乎没有其他已知的例子，液体直接与基质蛋白接触，而没有中间的细胞屏障。胶原纤维是一种带电分子，可形成重要的生理活性表面。免疫系统的细胞或其他穿过空间的细胞是否与胶原束相互作用是一个与生理学高度相关的问题，需要进一步研究。综上所述，虽然经典的间质描述表明细胞之间存在空间，但我们描述的是组织中宏观可见的空间动态可压缩和可膨胀的窦，间质流体在其内环流周身。我们的发现需要重新考虑不同器官的正常功能活动和疾病背景下紊乱的流体动力学，包括纤维化和转移。承受定向蠕动流的黏膜下层不是先前设想的致密结缔组织壁，而是一个潜在的导管，用于有害物质、促纤维信号分子和肿瘤细胞的移动。这就提出了一种可能性直接取样间质液可以作为诊断工具。最后，我们的研究证实了体内显微技术对正常组织和病变组织的解剖和生理学方面产生新见解的能力。方法病人和组织标本。我们招募了2012年7月至2013年12月期间在西奈山以色列医院进行胆道切除手术的13名患者。这项研究是在西奈山伊坎医学院(西奈山贝斯以色列医学中心)伦理审查委员会(IRB)的批准和相关指南和规定下进行的。所有参与本研究的患者均获得书面知情同意书 (包括术中注射荧光素和应用pCLE)，在显微镜下检查切除标本，并用探头型共聚焦激光显微内镜(pCLE)评价手术切口。纳入标准包括签署知情同意书及年龄18岁以上的患者。研究用的其他器官的组织是从固定的档案材料中获得的，不受IRB审查。术中、围手术期评估。在进行血管结扎和标本取出前，患者被注射了2.5 mL 10%荧光素(在所有病例中大约需要5-10分钟)。对最终切除的周围胆管、胰管和十二指肠壁标本进行进一步研究。样本取自注射荧光素患者(胆总管= 10,胰管= 3,十二指肠= 3,淋巴结= 1)和未注射的对照患者(胆总管= 3,胰管= 1,十二指肠= 1,淋巴结= 1)。一些手术样本足以使我们能够研究几种不同的组织。手术取样足够大，以便于我们能够研究不同的组织。样品处理和评估。样本取出后立即用pCLE（莫纳克亚山科技，Cellvizio Cholangioflex 微型探头）对标本进行体外扫描，证实网状结构和荧光素完好无损。标本被嵌入在甘油基OCT冷冻培养基并迅速使用气溶胶冷冻喷雾(托马斯Cyto-Freeze)，以确保荧光素保留和最小水晶体形成。标本嵌入时要么腔体向上，要么横截面向上。有些足够大的标本，可以一分为二在两个平面上评估。所有标本在-20储存。从胆管和胰管腔表层的正面开始，以5m厚度连续冷冻切片，直到深度为60 - 70m。我们还在胆管的横断面上进行了一系列的组织切片。标本放在载玻片上，不放固定剂且不进行风干，之后用二甲苯冷冻切片规程对标本进行处理，盖上盖玻片，用荧光显微镜和FITC感光滤光片(475-490纳米)进行评估和拍照。免疫组织化学染色。免疫染色按照标准程序进行22。固定标本先进行脱蜡。冷冻切片标本经风干加热固