版药典药品微生物限度检查法.ppt

2005版药典药品微生物限度检查法,概念,微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原料，辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数，霉菌数及酵母菌数及控制菌检查,环境条件,应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。洁净区域应定期进行洁净度验证。,培养温度,细菌为3035霉菌及酵母菌为2328控制菌为3537,检验量,一般供试品的检验量为10g或10ml，化学膜剂为100cm2。贵重药品，微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。,供试液的制备,液体供试品固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g（10ml)，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,混匀，为1：10供试液，,需用特殊供试液制备方法的供试品非水溶性供试品膜剂供试品肠溶及结肠溶制剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品,非水溶性供试品,取本品10g，置输液瓶中加无菌十四烷酸异丙脂20ml，充分振摇，使供试品溶解。然后加45pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油水明显分层，分别取其水层1ml加入平皿。,一、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性二、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对5株阳性对照实验菌株的回收率逐一进行验证）三、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)26003、大肠杆菌（Escherichiacoli）CMCC(F)44102、白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)98001、黑曲霉菌(Aspergillusniger)CMCC(F)98003四、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实验五、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上,验证试验,微生物检查方法,常规法培养基稀释法离心沉淀集菌法薄膜过滤法中和法,回收率测定1)试验组：分别1：10供试液1ml、50100cfu/ml试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌2)活菌组：测定每一菌株加的试验菌数3)供试液对照：测定供试品本底菌数4)稀释剂对照组,稀释剂对照组,供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。,1取经37培养18-24小时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-510-9，为50100个/ml，做活菌计数备用2取经25培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-510-7，为50100个/ml，做活菌计数备用3取经25培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加35ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加9ml生理盐水，逐管10倍稀释为10-410-6约50100个/ml，做活菌计数备用,菌液制备,常规法,(1)试验组:分别取1：10供试液1ml、试验菌株1ml同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时观察结果。每株试验菌平行制备2个平皿。(2)活菌组测定每一菌株的试验菌数各取试验菌液1ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时观察结果。每株试验菌平行制备2个平皿。(3)供试液对照测定供试品本底菌数取1：10供试液1ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2472小时观察结果。细菌、霉菌及酵母菌平行制备2个平皿。,回收率计算,样品回收率计算公式=(试验组平均菌数-供试液对照组平均数)活菌组平均菌数)*100%,表1菌落计数（cfu/ml）,试验菌实验次数试验组活菌组供试液对照组回收率大肠杆菌1544962600842988710294094345505557088金黄色160586775083葡萄球菌250455853086371737873095枯草杆菌149415855080%238424552082%374808588089%白色念珠菌110190103104092%279758189091%385839586093%黑曲霉161576865089%249475154091%3959410596094%,培养基稀释法,当供试品五种菌中有一种菌的回收率未达到70时，首先考虑用培养基稀释法。取规定量的供试液至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含菌量减少，至不含抑菌作用。一般可以0.5ml/皿，0.2ml/皿，0.1ml/皿,离心法,离心法有低速离心法和高速离心法低速离心法是500转/分离心5分钟，取上清液备用。高速离心法是3000转/分离心20分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml用。,薄膜过滤法,取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤.若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤.用7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量同计数方法的验证。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜.,验证时，加菌是在最后一次冲洗中，加入的菌量不要超过100个。同时应作稀释液回收。,薄膜过滤法注意事项：1.滤膜孔径应不大于0.45um,直径约为50nm.选择滤膜材质时应保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌.2.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面.3.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗冲洗量为100ml,每片滤膜的总过滤量不宜过大,以避免滤膜上的微生物受损.,4.阴性对照取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长.5.培养和计数培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌数应不超过100.6.菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数.若滤膜上无菌落生长,以1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品),或1乘以稀释倍数的值报告菌数.,中和法,针对品种选用特殊的中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂可以加在所用的稀释液或培养基中。,控制菌检查,控制菌检查方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查.若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证.,菌种对试验菌种的要求同细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证。大肠埃希菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌生孢梭菌菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养1824小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。,验证方法（1）试验组取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。如常规法取10ml供试液加1ml菌液加入增菌培养基。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。,（2阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。,（2阴性菌对照组如常规法作大肠埃希菌检查：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml及金黄色葡萄球菌菌液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，按大肠埃希菌检查法进行检查。,结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。,检查法供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。阳性对照试验进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。,举例,一.六味地黄丸微生物限度检查法,检验方法取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，使分散均匀，作为1：10供试液；取供试液按常规法测定细菌数、霉菌及酵母菌数，并进行控制菌和大肠菌群检查。,方法说明六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻，均没有明显抑菌作用。验证实验中，采用常规法测定5株验证菌株（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉）的回收率，均符合要求，故进行细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定。对于控制菌和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按常规法检验。注意事项用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀。,二、非水溶性供试品（含凡士林基质及乳膏剂）供试液制备,1、样品：红霉素软膏2、薄膜过滤法：取供试品10g，加至20ml十四烷酸异丙酯（必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量），充分振摇，使供试品溶解。然后加入45左右的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层，取其水层为1：10的供试液3、取供试液1ml注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的琼脂平板，置规定温度培养24-72小时，逐日观察结果4、阳性对照：薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌,三.双黄连口服液微生物限度检查法,细菌数测定取本品原液，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜（约100ml/次，冲洗3次），测定细菌数。以金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003为阳性对照。霉菌及酵母菌数测定取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数。控制菌检查取本品原液1ml加入100ml胆盐乳糖增菌液，按常规法测定。,本品对金黄色葡萄球菌较敏感，实验中为保证结果的准确性，可以增加金黄色葡萄球菌作为阳性对照，如阳性菌能正常生长，说明冲洗等操作正确。对于控制菌检查，虽然本品对大肠埃希菌具有一定抑菌活性，但取原液1ml加入100ml胆盐乳糖增菌液（1：100倍稀释）后，再加入10100cfu大肠埃希菌，与不加供试液的阳性对照比较，生长正常，故控制菌检查仍可按常规法检验。,四.培养基稀释法微生物限度检查,控制菌检查取1:10供试液10ml，加至100ml450.1%无菌蛋白胨水溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以450.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜（约100ml/次，冲洗3次），取膜至含2ml-内酰胺酶的胆盐乳糖增菌培养基（100ml/瓶）中，检查控制菌。以大肠埃希菌CMCC（B）44102为阳性对照。,革兰染色、镜检,操作步骤制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过结晶紫染色-1分碘液媒染-1分乙醇脱色-30秒沙黄复染-30秒,染色结果,革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株,革兰染色注意事项,玻片必须洁净涂片菌量宜少，菌不可浓新鲜培养物脱色是关键,革兰染色意义,初步识别细菌，利于进一步鉴定初步选择治疗用药物与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主,一、大肠埃希菌检查法,对照用菌液菌种为大肠杆菌（）44102对照菌液加入量：含菌50100菌落形成单位的控制菌菌液制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，361培养1824h后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：106其用途：做阳性对照检查培养基灵敏度,操作步骤,增菌培养取胆盐乳糖（）培养基3瓶，每瓶各100ml2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入含对照菌50100个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照37培养1824h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液,MUG试验原理,4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被-葡糖苷酸酶（GUD）水解，产生荧光实验证明96的大肠杆菌含GUD，约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6，鉴于98的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色）如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别,MUG试验操作,以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入MUG培养基，37培养5、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加靛基质试液45滴于上述MUG管内，观察液面颜色,结果观察,取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管,MUG与靛基质试验结果判定,如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养1824h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌,大肠杆菌在不同培养基上菌落形态特征,当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMViC试验,疑似菌落的挑选,如生长菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选23个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养1824h，作检查无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养1824h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下革兰染色、镜检以及生化试验,乳糖发酵试验,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养2448h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）假阴性的处理：为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间,靛基质试验（I）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448h，沿管壁加入欧波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性阴性培养物的进一步检查：一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作试验,甲基红试验（）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于培养液中加入甲基红指示液23滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察结果观察：呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。,乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于2ml培养液中加入-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内观察结果结果观察：出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性,枸橼酸盐利用试验（C）,操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养24天结果观察：培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性注意事项：枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2天是不够的，故试验培养时间改为24天,结果判断,当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌。MUG阴性、靛基质阴性，报告lg或1ml供试品未检出大肠杆菌MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+-、革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为+-、革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌供试品培养物检查不符合上述二项中的任一项，报告lg或1ml供试品未检出大肠杆菌当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。,IMViC试验的顺序,以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果,大肠菌群的检查,大肠菌群的检查与大肠杆菌有相似之处，应当将分纯的菌种进行大量的生化试验来区分菌种。利用乳糖产酸产气者进行进一步鉴别,大肠菌群菌落形态特征,菌落疑似者再进行确证试验菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出,大肠菌群数的推算,二、沙门菌检查法,对照用菌液乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内。361培养1824h后，用0.9%无菌氯化钠溶液释至1：106，浓度相当于50-100个cfu/0.1ml,增菌培养,3.1.1预增菌取营养肉汤培养基3瓶，每瓶各200ml，2瓶加入1：10供试液各10ml，其中1瓶加入对照菌液0.1ml(含菌量为50100个cfu/ml)作阳性对照，第3瓶加入稀释剂10ml作阴性对照，培养1824h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效3.1.2增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1ml各接种于1管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824h。阳性对照管应呈现混浊,分离培养,轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取12环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养2448h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落,沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表,菌落特征补充,由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别,菌落传纯,从每个供试品的分离平板上挑取23个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养242h，观察结果,三糖铁琼脂反应,疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；斜面红色，底层黄色；斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。疑似沙门菌，应取三糖铁琼脂斜面得培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验确认是否为沙门菌。,三、铜绿假单胞菌检查法,对照用菌液铜绿假单胞菌CMCC(B)10104营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于361培养1824h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌加入量含50100个cfu(一般用量为0.1ml)，菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定,增菌培养,取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入1：10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml)，其中一瓶加入含对照菌50100个菌落形成单位的菌液作为阳性对照。第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照361培养1824h(必要时可延至48h),分离培养,增菌培养液12环(如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板于361培养1824h铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。当阳性对照平板无菌落生长或生长菌落经检查不是铜绿假单胞菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响,纯培养,供试品分离平板生长上述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取23个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查,初步鉴别试验,革兰染色镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列氧化酶试验：铜绿假单胞菌呈阳性绿脓菌素试验:铜绿假单胞菌呈阳性,结果报告,供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、41生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌凡与上述结果不符时报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌,四、金黄色葡萄球菌检查法,对照用菌液金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，361培养1824h，用0.9%无菌氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1：106，加入含50100个cfu的对照菌菌液(一般用量为1：1060.1ml)，同时用营养琼脂平板计