【毕业学位论文】（Word原稿）瘤胃微生物Real Time PCR定量方法的建立及其应用动物营养与饲料科学博士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 博士学位论文 瘤胃微生物 of a s s of a I 摘 要 本研究 分别 以产甲烷菌 、原虫和瘤胃细菌 为例， 根据其 16S/18S 列、 列和特有蛋白的基因序列，利用 术，分别在种和类的水平上，建立了对瘤胃微生物绝对定量与相对定量的分子生物学方法，为瘤胃微生物的研究提供了一种快速、准确的方法。同时，应用此方法研究了 植物油对瘤胃中产甲烷菌数量、氢化细菌数量及原虫数量的影响，探讨 了 植物油降低瘤胃微生物甲烷产量的途径。 提取采用珠磨 酚氯仿法。提取的瘤胃微生物总 20上， 提取效率 达 利用真细菌、古细菌和真菌 16S/18S 通用引物从纯化 后瘤胃微生物总 成功扩增出目标条带，表明 珠磨式机械破碎法 能充分破碎包括细菌、真菌、原虫在内的各种瘤胃微生物 ，并满足后续实验的要求 。 利用 、 、 、 、 、 6 种限制性内切酶将基因组酶切 ，通过 交确定 M. 16S 列在基因组中有 2 个拷贝 。设计了 M. 专一探针，通过在 用 行比对，证实该探针特异性很高。 对 M. 应条件进行 了优化，其最佳体系为 ： 引物和探针的浓度分别为0.4、 0.2， ，模板浓度为 126测灵敏度可达到 30 拷贝 /25M. 用 法测得的数量低于采用传统最大或然数法测得的数量，但两者之间具有很高的相关性（ r= P 说明 采用 方法能够如实的反映瘤胃微生物数量的变化 。 以 靶序列 ， 采用 荧光染料 成功对 M. 行了定量检测，有效检测灵敏度可达 300 拷贝 /25L 体系。同时，以微生物合成甲烷过程中的关键酶 采用 荧光染料 ， 建立了瘤胃总产甲烷菌相对定量方法。利用上述方法，分别对肉牛、奶牛瘤胃中的 M. 产甲烷菌进行了检测，结果表明 所测得的 肉牛 瘤胃中的 M. 产甲烷菌 的数量远高于 奶牛，这可能与肉牛日粮中粗料 比例较高有关。同时， 采用 荧光染料 成功 对 行了定量检测。 日粮中添加 4%棉籽油和 4%豆油均降低人工瘤胃中微生物的甲烷产量，但二者之间无显著差异。不同时间段内，甲烷产量降低的幅度不同，其中采食后 24h 内甲烷产量降低的幅度最大，与对照组相比，分别降低 P 46h 次之， 68h 变化最小。添加 4%棉籽油和 4%豆油，使人工瘤胃中的 M. 产甲烷菌、 B. 与对照组相比， 添加 4%棉籽油组和添加 4%豆油组， 7d 中部采样 M. 产甲烷菌、 B. R. 数量 分别减少了 100%、 100%， 在底部采样中，分别降低了 100%、100%， 上述结果显示，植物油主要是通过杀灭瘤胃原虫，从而 减少产甲烷菌数量以降低甲烷的生成。 关键词： 胃微生物，定量，植物油，甲烷 of by CR as of in on 6S /18S of of of on of CR of At of on of by of of NA by a NA 0NA of NA we 6S of by of NA in of It by of NA A it by We . of .4, 0.2 260ng CR . . be 0 5L . by CR . by of r= P by CR of s We . by CR TS as a . be 00 5L At we of by CR of as a it . of of by it to of in We by CR he %to %P of at of h h K, P h h h h %to At %K, 00% & 100%，& & & & in 00% & 100%， & & & & in of by to of V 目 录 第一章 文献综述 1 1 瘤胃微生物的主要种类 1 2 瘤胃微生物对动物生产和健康的影响 2 胃微生物对动物生产的影响 2 胃微生物对动物健康的影响 4 3 瘤胃微生物的定量方法 5 统定量方法 5 子定量方法 6 子定量方法中的靶核酸片段 7 胃微生物评价方法的发展趋势 8 4 究进展 10 量原理 10 光标记的种类 10 量方法 11 应用 12 5 反刍动物甲烷生成的机理与调控 13 烷生成的生物学机理 13 烷生成的调控 16 6 研究目的、意义及主要内容 19 第二章 瘤胃微生物 量方法的建立 20 1 前言 20 2 材料和方法 20 料 20 法 27 3 结果与分析 48 胃微生物总 提取与纯化 48 . 标片段的克隆测序 52 . 应条件的优化 55 . 6S 贝数的确定 57 . 6S 准曲线的制作 59 品中 M. 定量 60 . 标片段的克隆测序 62 V . 应体系的建立 65 . 准曲线的制作 66 产甲烷菌的 量方法的建立 68 胃 对定量方法的建立 72 胃 相对定量方法的建立 73 胃 相对定量方法的建立 74 胃中产甲烷菌的定量 75 4 讨论 78 胃微生物 量方法的建立 78 瘤胃微生物定量评价中的应用前景 82 5 小结 84 第三章 植物油对反刍动物甲烷产量和瘤胃微生物数量的影响 85 1 前言 85 2 材料和方法 85 料 85 法 87 3 结果与分析 90 物油对甲烷产量的影响 90 物油对 M. 量的影响 92 物油对总产甲烷菌数量的影响 93 物油对纤毛虫数量的影响 94 物油对 B. 量的影响 95 物油对 量的影响 96 4 讨论 98 粮中添加植物油对瘤胃中甲烷产量和产甲烷菌的影响 98 粮中添加植物油对瘤胃中 量的影响 99 粮中添加植物油对瘤胃中 量的影响 99 刍动物日粮中添加植物油影响甲烷产量机制的探讨 100 工瘤胃模拟实验的可行性与局限性 101 5 小结 102 第四章 论文总体结论、创新点及需进一步研究的问题 103 1 结论 103 2 创新点 104 3 有待进一步研究的问题 104 参考文献 105 录 1 计 物的种内完全保守序列 116 附录 2 M. 计扩增产物的相似性比较 116 附录 3 确定 M. 6S 贝数的杂交探针序列 117 附录 4 M. 隆片段的测序结果 117 附录 5 M. 物序列的相似性比较 118 致谢 121 作者简历 122中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 反刍动物在长期的自然进化过程中获得了独特的瘤胃发酵系统。瘤胃内栖息着多种多样的微生物，形成一个十分复杂的微生物系统。经过长期的选择和适应，瘤胃微生物和宿主之间及微生物之间形成了一种相互制约、相互依赖的动态平衡。这种平衡对于维持反刍动物的 机体健康、提高反刍动物的生产性能、减少环境污染及保证产品安全等方面具有重要作用。因此，对瘤胃微生物的研究一直是反刍动物营养研究中的重点领域。然而，由于瘤胃微生物数量巨大、种类繁多，且绝大多数严格厌氧，体外培养困难，极大地阻碍了对瘤胃微生物的研究。建立一种准确、快速、高效的瘤胃微生物定性及定量评价方法，对于促进瘤胃微生物研究具有非常重要的意义。 1 瘤胃微生物的主要种类 瘤胃微生物主要包括细菌、原虫、真菌和噬菌体等几大类，其中 细菌 的 数量 很 大，每 胃 内容 物细菌 达 10101011 个，已从瘤胃分离出的有 200 多种（见表 1 瘤胃原虫 104106 个 /氧真菌游动孢子数 103105/菌体颗粒数可达 107109/2003；朱伟云， 2004）。瘤胃微生物的种类和数量受动物的机体状态和饲粮结构等因素的影响。 细菌在瘤胃发酵过程的各个方面都扮演着重要的角色 （ ， 1990； ， 2001）。原虫虽然数量比细菌少，但由于其体积大， 占瘤胃中微生物生物量的 30%80%（ ， 1980），驱虫研究表明瘤胃原虫不是反刍动物所必需的，它能吞噬大量细菌， 导致了原虫和细菌多样性的逆反关系，而且许多原虫能吸收和贮藏小淀粉颗粒，因此可调整发酵效率，使动物免于酸中毒；然而，原虫捕食细菌及自身裂解过程剥夺了动物的微生物蛋白，增加了进入瘤胃的氨；另外，一些原虫似乎消化纤维素，其消化的纤维素能达到总纤维素的 1/3。瘤胃真菌有一个相对长的生活史（ 24 至 32h），只饲喂劣质粗饲料的反刍动物似乎有更大的真菌群落，可占瘤胃生物量的 8%（ ， 1997）。 2 瘤胃微生物对动物生产和健康的影响 瘤胃可看作是一个能够供嫌气性微生物繁殖的连续接种的活体发酵罐（温度为 化还原电位为 这为瘤胃微生物区系的建立与维持提供了有益的环境，反过来瘤胃微生物区系建立又有益于宿主 满足宿主的营养需要，这种生态系统及共生关系使得瘤胃具有了其独特的生理、生态特性 利用微生物间的协同作用把纤维素、半纤维素等单胃动物不能利用的碳水化合物发酵成 可利用 合成含各种必需氨基酸的微生物蛋白质，还可利用发酵产物合成各种 B 族维生素，在改善饲料品质的同时又建立了一种瘤胃微生物间的动态平衡。 胃微生物对动物生产的影响 反 刍动物利用的大部分营养物质（主要是 微生物蛋白质）是各种瘤胃微生物协同发酵的终产物，但在此过程中伴随着能量和氨基氮等养分的损失，因此，微生物的生长状态与瘤胃中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 发酵的效果和动物生产性能息息相关。瘤胃微生物对动物生产的影响主要体现在以下三个方面： 表 1瘤胃中的主要细菌 in 要类型 主要发酵底物 代表菌种 革兰氏染色反应 纤维素分解菌 可溶性碳水化合物 产琥珀酸拟杆菌 黄化瘤胃球菌 溶纤维丁酸弧菌 （ -） （ +） （ -） 半纤维素分解菌 纤维素、半纤维素、可溶性碳水化合物 居瘤胃拟杆菌 瘤胃球菌 溶纤维丁酸弧菌 （ -） （ +） （ -） 果胶分解菌 果胶、可溶性碳水化合物 牛链球菌 溶糊精琥珀酸弧菌 居瘤胃拟杆菌 （ +） （ -） （ -） 淀粉分解菌 直链淀粉、淀粉、糊精 嗜淀粉拟杆菌 牛链球菌 解淀粉琥珀酸单胞菌 （ -） （ +） （ -） 尿素分解菌 尿素 新月单胞菌 丁酸弧菌 居瘤胃拟杆菌 （ -） （ -） （ -） 产甲烷菌 甲酸、二氧化碳 反刍兽甲烷杆菌 甲酸甲烷杆菌 动式甲烷菌 (+) (可变 ) （ -） 单糖利用菌 葡萄糖、单糖 酸杆菌 酸杆菌 （ +） （ +） 中间酸利用菌 乳酸、琥珀酸、甲酸 刍兽新月单胞菌 （ -） （ -） 蛋白分解菌 蛋白质、寡肽 嗜淀粉拟杆菌 居瘤胃拟杆菌 牛链球菌 （ -） （ -） （ +） 产氨菌 氨基酸、尿素 居瘤胃拟杆菌 -） （ -） 脂肪分解菌 半乳糖脂、磷脂 反刍兽新月单胞菌 脂肪分解厌氧弧菌 溶纤维丁酸弧菌 （ -） （ -） （ -） 响 动物的能量利用效率 瘤胃微生物主要是影响 生成比例及利用效率、发酵产热与甲烷的生成，从而影响动物对饲粮中能量的利用效率。动物采食以粗饲料为主的饲粮时，微生物发酵终产物中的乙酸较多，中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 动物采食以精料为主的饲粮时，微生物发酵终产物中的丙酸较多，而乙酸：丙酸比例的大小又与能量利用效率成线性相关。冯仰廉（ 1991）在报道中指出，当乙酸：丙酸：丁酸的比例为 75： 15：10 时，其能量利用率是 32%，但当它们的比例为 25： 45： 30 时，能量利用率为 58%。这是由于发酵的中间产物己糖转化为乙酸、丙酸和丁酸的效率分别是 62%、 109%和 78%，而且丙酸转化为糖、脂肪和蛋白质的碳架时消耗的 少，同时它还是 唯一生糖的挥发性脂肪酸，反刍动物体内的大部分葡萄糖来源于丙酸。王中华等（ 1999）的研究表明随着瘤胃乙酸：丙酸比例的升高，葡萄糖的合成速度加快，丙酸用于糖异生的比例增加；冯仰廉（ 1991）的研究表明丙酸比例增高时，体内氮平衡也随之增高，增加瘤胃中非降解养分或添加丙酸盐对能量沉积、体脂肪和体蛋白沉积及代谢能利用率有明显的促进作用。 瘤胃微生物无效活动所造成的自由能的损失 发酵热占反刍动物食入饲料总能的 3%12%，远远高于单胃动物（只占 1%）。有人指出饲料品质和采食量对发酵热的影响很大，通过饲料处理技术可控制微生物的发酵方向，以减少发酵热的产生。 甲烷气的产生除了对环境造成污染外，它也是瘤胃能量损失的主要部分 约占反刍动物食入饲料总能的 8%；饲粮精粗比、饲料添加剂（如离子载体 莫能菌素和甲烷抑制剂等）、饲料脂肪、饲料碳水化合物状态、原虫驱除等均可通过改变甲烷菌的数量来控制甲烷的生成量（赵玉华等， 2005；郭嫣秋等， 2005）。 响动物的氮素转化效率 瘤胃微生物主要是影响氨基氮的损失和 有效 利用。一些蛋白质分解菌，如 和氨基酸分解菌，如 厌氧消化链球菌（ 斯梯克兰梭菌（ 嗜氨梭菌（ 数量的变化会造成瘤胃氮素转化效率的不同，进而影响氨基氮、 流出量及其平衡，最终将决定蛋白质、氨基酸和 尿素）的损失情况。 响瘤胃发酵 与动物消化平衡 不同发酵类型的瘤胃微生物数量及比例的变化导致瘤胃发酵平衡、动物消化平衡的动态移动，进而影响动物的生产性能。瘤胃中各种蛋白质分解菌、碳水化合物分解菌，包括淀粉分解菌和纤维素分解菌等的不同比例将导致饲料发酵平衡的变化：蛋白质降解速率大于碳水化合物发酵速率（氮素将以氨的形式损失掉）或蛋白质降解速率小于碳水化合物发酵速率（动物合成的蛋白质可能满足不了机体需要），或瘤胃中饲料降解很慢，瘤胃充满以致动物采食量下降，一些饲料未经发酵而直接进入下段消化道。在瘤胃发酵与动物消化平衡方面，如果碳水化合物不经瘤胃 发酵，就会减少瘤胃微生物的生长，进而降低氨的利用；如果降低蛋白质在瘤胃的降解，虽能减少氮素损失，却引起微生物总量减少，使微生物蛋白的合成效率下降。 胃微生物对动物健康的影响 有些瘤胃微生物的存在或过量繁殖可影响动物健康，严重的导致疾病发生甚至死亡。当牛的饲粮突然从粗料变成谷物时，由于淀粉发酵菌、乳酸产生菌（牛链球菌和乳酸杆菌）的过分生长中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 将导致瘤胃严重酸化（瘤胃 造成急性酸中毒；但若日粮的变化是逐渐的，埃及巨球形菌和反刍兽新月单胞菌能把乳酸转化成乙酸和丙酸，瘤胃 不会受到严重影响， 瘤胃生态环境也不会发生显著变化（ ， 1998； ， 2000）。微生物产生的高浓度挥发性脂肪酸也能产生亚急性瘤胃酸中毒，瘤胃上皮未被黏膜保护，短时间亚急性酸中毒也能导致炎症、溃疡和疤痕（ ， 1998）。 乳酸积累促进了坏死梭杆菌，一种利用乳酸、感染瘤胃溃疡面的细菌的增殖。如果坏死梭杆菌通过瘤胃，定植在肝脏，可形成脓疮；坏死梭杆菌还产生白细胞毒素和内毒素脂多糖（ 1998）。如果 缓慢的酸化，上皮释放产生降解组织的金属蛋白酶。如果这些金属蛋白酶进入血液，将导 致动物蹄叶炎发生，使动物变瘸，最严重时，会导致蹄甲脱落。 一些发酵淀粉的瘤胃细菌能分泌多糖，这些多糖能产生导致家畜气胀病的泡沫。因为进入泡沫中的气泡不能排出，所以瘤胃会膨胀。如果这个气压很高，使瘤胃挤压肺部而导致动物窒息（ ， 1998）。 除影响动物本身的健康外，部分瘤胃微生物也会影响消费者的健康。大多数大肠杆菌（ E. 无害的，但肠出血性 E. 导致人类急性疾病的发生。如食物被彻底蒸煮的话， E. 157： 会带来问题；但对一些未经过充分加热 的食品，如汉堡牛排则是 E. 157： 来源（ ， 1996）。在美国每年约有 62000 人被感染此菌（ 2000）。一般估计只有 0 3%圈养牛是无症状的携带者（ 1997），但最近研究表明 E. 157：发生率至少是原估计数量的 10 倍 （ ， 2000）。 瘤胃微生物除对动物的生产和健康产生影响外，还有许多其它有益的作用，如瘤胃微生物可分泌一系列的纤维素降解酶（包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶等），并且瘤胃真 菌所分泌的酶活性比目前工业上常用的产纤维素酶木酶菌等工业用产酶微生物分泌的酶活性都高（王全军等， 2000），因此可利用瘤胃微生物酶作为新的酶源来增进畜牧业的生产能力（郑国展， 1999）；瘤胃微生物还可应用于环保方面，国外利用瘤胃微生物来处理垃圾（包括不易降解的有机垃圾、农业残余物和有毒垃圾等）研究很多（陈庆今等， 2001）；瘤胃细菌产生的细菌素对瘤胃中革兰氏阳性菌具有选择性抑制作用，有望用来调节瘤胃微生物区系平衡和改变瘤胃发酵类型（张元庆等， 2004）。 3 瘤胃微生物的定量方法 统定量方法 释平板记数法 稀释平板记数法又称活菌记数法，是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一特征设计的记数方法。菌落记数时，先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，成单个细胞存在，然后取一定稀释度、一定量的稀释液与固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上，经培养后用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。瘤胃液中细菌或真菌的活菌记数常采用滚管法。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 5 稀释平板测数法这是一种最常用的活菌计数法，此法不 仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。此外，对一些在实验室难于培养的微生物，无法利用该法进行检测，而且，由于不同微生物的最适培养基、培养条件不同而导致生长速度不同，使得记数结果与实际菌数差异较大。 大或然数法 最大或然数（ 数法又称稀释培养测数法，是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其它微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和 丰度，是目前比较常用的方法。方法是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到少量的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体如下，菌液经多次稀释后，