【毕业学位论文】（Word原稿）拟除虫菊酯降解基因的克隆生物化学与分子生物学硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 拟除虫菊酯降解基因的克隆 of of I 摘 要 不动杆菌（ 菊酯类等化学农药具广谱、高效的降解作用。本研究以该菌株为原始材料，以 过同尾内切酶 功构建了 库的库容约为 104、插入 片段长度约为 2 7 利用农药 取在农药平板中生长、在酯酶筛选平板上形成透明圈的重组菌株。对筛选得到的重组菌株 2验结果表明：该重组菌株具酯酶活性，其比活力为 为胞外分泌型酶。该重组菌株作用高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯 108 h 后，降解率分别为 作用丙溴磷和哒螨灵 72解率分别为 对 2入的大小约为 3.2 对亚克隆片段进行核苷酸序列测定、拼接，得到长为 1854完整阅读框架，编码 617个氨基酸的基因序列。该序列与假单胞菌 的 4%的相似性。以原始菌株 据文库实验中获得的 个实验结果表明本研究已获得来源于不动杆菌（ 有农药降解活性的脂肪酶基因，该基因序列已在 册号为 现有文献表明脂肪酶基因功能中未见有降解农药的报道，本实验首次克隆到了具有广谱农药降解活性的脂肪酶基因。 关键词 不动杆菌 拟除虫菊酯， 基因组文库，重组菌株，脂肪酶，降解 of as as in kb as We 04. on 7 . in it 08 h. to , to 2h. a It a 17 it 4% . It a of to is no So of at ， 录 第一章 绪论 . 1 除虫菊酯类农药 . 1 除虫菊酯类杀虫剂的发展 . 1 国菊酯类农药现状 . 3 药残留及危害 . 3 现状 . 3 决方法 . 4 微物生物修复农药残留 . 6 解拟除虫菊酯类农药的微生物种类 . 6 生物降解农药的途径 . 7 研究的目的与意义 . 11 第二章 构建不动杆菌（ 因组文库 . 12 料与试剂 . 12 料 . 12 验仪器 . 12 学试剂 . 12 验方法 . 13 体菌 含有 粒 菊酯类农药的降解情况和酯酶活性测定 . 13 因组 取 . 15 粒 取（碱裂解法） . 15 因组 分酶切体系 . 16 体 全酶切体系 . 16 受态制备 . 17 化 . 17 验路线图 . 17 机挑选重组验证文库包含外源片段大小 . 18 验结果 . 19 高效氯氰的降解能力及其在平板上生长情况的检测 . 19 酯酶活性测定 . 19 粒的提取 . 20 菌基因组 分酶切和载体 全酶切 . 21 的 片段与载体的连接、转化 . 22 机挑选重组验证库外源片段大小 . 23 论 . 23 第三章 文库筛选获得农药降解重组 子 2其降解性能 . 25 料与试剂 . 25 验材料 . 25 验试剂 . 25 验方法 . 25 性克隆筛选 . 25 重组子降解性能的检测 . 26 验结果 . 27 菊酯降解能力重组子的筛选 . 27 组子 2粒提取及酶切验证 . 27 组子，原始菌株，和 有 酯酶比活力 . 27 组子降解能力的测定 . 28 论 . 32 第四章 重组子 2因亚克隆与序列测定 . 33 料与试剂 . 33 验材料 . 33 验试剂 . 33 验方法 . 33 源片段基因亚克隆 . 33 列分析与 对 . 34 因克隆 . 34 验结果 . 35 因片断的亚克隆及序列分析 . 35 因片断的亚克隆 . 36 个亚克隆之间序列扩增与测定 . 37 因序列拼接、分析、比对与注册 . 38 因克隆 . 45 论 . 48 第五章 全文结论与展 望 . 49 致 谢 . 59 作 者 简 历 . 60 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 除虫菊酯类农药 除虫菊酯类杀虫剂的发展 拟除虫菊酯类杀虫剂（ 仿效天然除虫菊化学结构的合成农药。由于其杀虫谱广、药效高，对哺乳类动物毒性一般较低，且在自然环境条件下降解速率较其它农药快，深受农户的欢迎（ 庞国芳等， 1998）。随着现代农业的发展，农药已经成为现代农业不可或缺的生产资料之一，在农业增产、增收方面起着重要作用。随着有机氯、有机磷等毒性高、降解慢的农药的禁用，使得拟除虫菊酯类农药成为现今我国施用面积渐为广泛的农药之一。 2005年拟除虫菊酯类农药的销量上涨 张晓， 2005）。 14 早种植于秘鲁和南斯拉夫。 1828年英国 于防治卫生害虫，这是早期农药发展史上的重要事件（梁卫驱， 2005）。 20世纪 20年代，鉴定出天然除虫菊杀虫剂的有效成分为除虫菊酯 I。60年代，人们了解到除虫菊酯结构上的两个光不稳定中心，分别位于醇部分和菊酸乙烯侧链的偕二甲基部分。 1973年英国洛桑研究站的 0是菊酯类农药 应用于农业的一个里程碑。 1976年日本研究人员 以提高菊酯类农药的毒效（肖红利， 2004）。据此人们开发了很多光稳定、毒效高的拟除虫菊酯类农药，如溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯等。这样使得菊酯类杀虫剂在卫生和农用方面迅速扩大了施用面积。 传统的羧酸酯类拟除虫菊酯虽然具有高效、广谱、击倒快的特性，但也存在高鱼毒和靶标害虫抗性日趋严重的缺陷。羧酸酯是拟除虫菊酯具有杀虫活性至关重要的结构部分，随着研究的逐渐突破，合成了大量的以肟醚、醚、酮、 烯烃等取代酯键的化合物，发现许多活性优异，鱼毒低或具有杀螨活性的化合物，并且这些化合物仍具有拟除虫菊酯农药的活性特点，从而使拟除虫菊酯的化学结构从羧酸酯型扩大至非羧酸酯型化合物，如醚菊酯、乙氰菊酯等。不但降低了生产成本，而且还扩大在水田和水产养殖业的使用。 科研人员利用不断完善的结构和活性关系，逐步对其分子结构中醇部分、酸部分和酯部分进行改造修饰设计各种含酯类或非酯类新化合物 。现在研究人员正在不断研究 究如何得到单一的光学异构体，例如固相合成技术的应用以及与之相连的单一分离技术的研究（ et 2002）；采用生物酶技术合成菊酯醇部分的单一光学异构体（ 1998）；利用光化学的重排技术合成菊酯类产品的酸部分（ et 1995）；手性催化剂的研究和利用（ et 2001）等。利用经典方法研究开发拟除虫菊酯的同时，利用生物技术生产天然除虫菊酯的设想也在进行，例如：用试管培养除虫菊植株组织来生产除虫菊素；美国尤他州 移到微生物上，按 除虫菊素生物合成步骤，在生物反应器 (人工控制生产。目前，虽然这两种技术生产成本仍高于人工种中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 植而被停止，但是开创了研究菊酯的新思路（ 1994）。除此以外，科研人员还在研究各种分离技术，以方便、简单的获得高活性的单一光学异构体，并从分子水平和遗传学的角度研究拟除虫菊酯类产品抗性机制。 目前已有拟除虫菊酯类农药工业产品 50多种，但是遗憾的是在提高菊酯稳定性和毒效的同时，该类农药的对人畜的安全性也随之降低，今后该类农药的研究应该向提高人类、环境安全性的方向发展。 经过对天然除虫 菊酯结构的不断修饰和改造，目前拟除虫菊酯类人工合成的农药因其对环境相对友好，已经在农作物和室内卫生害虫的防治和控制过程中发挥了重要作用，但是在该类农药的活性与抗性之间总是难以权衡，大部分产品都是高鱼毒性和低杀螨性，所以拟除虫菊酯类农药的研究将集中于开发新型的、具有特殊活性的化合物，提高对害虫和螨类的活性，降低害虫抗性和对鱼类的毒性，目前有研究表明，通过引入吡啶环等各种杂环，可以提高菊酯类农药的杀螨活性（ 马军安等， 2003； 2002；张田林等， 2003）；在活性分子中引入氟原子，可以在提高生物 活性的同时，降低生物体的抗药性（ 2002； 2004；邹新琢， 2003）；菊酯的烃类和醚类类似物对鱼类低毒（ 胡志强， 2002），并且硅原子的引入在某种程度上会改变化合物的作用特性，此类研究都在进行中，加快对低毒性，环境效应好的菊酯类产品开发，将会对我国农业的可持续发展起促进作用。 菊酯类农药同时具有驱避、击倒和毒杀三种不同作用，一般认为驱避作用是菊酯作用于感觉器官上引起的反应，它在极低浓度时，即有效，因此不会影响到神经系统的其他部分，与击倒及毒杀机制完全无关。有关击倒和毒杀的作用机制和作用部位存在着争论，一种说法认为击倒致影响周围神经，而毒杀是破坏了中央神经系统。此说法的根据是，用菊酯处理昆虫时，击倒发生的时间大约正好是药剂渗入表皮的时间，而毒杀发生的时间则较晚，因此击倒致可能到达周围神经系统，而毒杀发生时才可能到达中央神经系统。而相反的实验证明，不论用滴加法或者注射法处理，同样产生击倒，后来同样产生毒杀效应，因此认为击倒与毒杀都是对中央神经系统的影响，致使中毒程度不同，即击倒时毒杀的初步征象，击倒后不继续中毒即会恢复。 目前菊酯类农药的毒理机 制还没有完全阐明，各类说法还存在许多不明确和有争论的地方（杨小平， 1999）。 拟除虫菊酯在哺乳动物体内吸收、分布、代谢转化均非常快，用杀灭菊酯给鼠类经口染毒（ 8 1小时后血浓度即达高峰， 24小时降至 4以下， 48小时难以测出。吸收后在体内经酯酶和混合功能氧化酶的作用，被水解、氧化和结合，降解代谢主要在肝内进行。含氰基者氰基的排出比较缓慢，最终以硫氰酸盐排出。致毒机制至今尚未完全阐明，目前的研究认为它影响细胞膜的功能，干扰钠离子通道，导致钠通道的闸门关闭延迟，形成除极后电位及重复除极，持续地重复发放神经冲动，将使膜内钠离子梯度衰减，最终引起神经传导阻滞。此外，拟除虫菊酯作为神经毒物，它尚可抑制神经细胞膜的 氨基丁酸受体，使该介质失去对脑的抑制功能。国内曾报道 3例溴氰菊酯中毒者，脑脊液中 氨基丁酸含量明显高于正常水平。动物试验中，尚发现中毒动物细胞第二信使之一的兴奋性递质环鸟昔酸（ 高。这些研究，对以中枢兴奋抽搐，其后转入中枢抑制的全身中毒症状，提供了比较合理解释的基础。该类杀虫剂对皮肤、黏膜污染的局部也有刺激作用，除接触性损害外，尚可引起局部迟发过敏反应（何凤生， 1983）。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 国菊酯类农药现状 我国在 20世纪早期开始在安徽、上海、浙江等南方地区种植除虫菊， 30 40年代赵善欢等开始对天然除虫菊的组分进行研究， 1956年北京农业大学黄瑞纶在杀虫药剂学专著中详细介绍了除虫菊化学有效成分等。 1972年在程暄生的指导下，江苏省农药研究所首先在国内开展了拟除虫菊酯的合成研究。随后很多强有力的科研单位和高校纷纷与专业生产厂结合，迅速将科研成果转化为生产力，同时也涌现了许多技术雄厚的专业生产厂。由于部分地区对害虫和害虫抗性的综合治理的不合理性，导致害虫对拟除虫菊酯类农药的抗药性迅 速发展，严重影响了拟除虫菊酯类产品的使用寿命，而且导致农民盲目加大施用剂量，增加了环境自身净化污染物的负担，一些科研单位对害虫的抗药性机制进行了大量研究，研制了各种菊酯类农药与其它农药如有机磷、氨基甲酯类农药的混配制剂，如乐果 硫磷 时菊酯类农药的增效剂如增效醚、八氯二丙醚等，得到了广泛应用。目前我国形成一支相当强大的研究队伍，在系统研究开发拟除虫菊酯类杀虫剂和各种混配农药剂型，以及各种菊酯农药增效剂和助剂等领域都有所成就（王朝晖等， 1997），现在已经成为研究和生产菊酯类 农药的大国之一（胡志强， 2004）。 药残留及危害 现状 农药作为目前农业增产的主要依靠 ,在农业中具有广泛的应用，是人类主动向自然界投放的毒性化学物质（王让会， 1998）。通常，我们把残存在环境中和生物体内的微量农药称作残留农药，它包括农药原体残留量及其具有比原体毒性更高或相当毒性的降解物的残留量（张韩杰， 2004）。目前我国农药的施用方法仍以药液喷洒和粉剂喷洒为主。有研究表明（李本量 ,1995）：施用农药后 ,仅有 1% 2%的药作用于防治对象本体 , 有 10% 20 %附着在作物本体上 ,其他 80% 90 %的农药主要散落在农作物的周边环境 ,如农田、土壤或漂浮于大气。 大气中的农药残留主要来自于农药在防治害虫、杂草等时的喷洒和农药生产过程中的烟尘；土壤中的农药残留则主要由于直接喷洒或间接落入，利用污染水源灌溉也是导致土壤中农药残留的主要因素之一；水体中的农药残留除水田或者水产养殖直接施用外，大气和土壤中的农残也会随雨水造成水质污染。随着菊酯类农药使用的日益广泛，使用时间逐渐增长，以及农民对农药的不合理施用，同时由于靶标害虫抗药性，使得在农药使用中，不断增加施用量，增加了环境自净负荷，目前在全 世界范围内各种有机农药残留现状非常严重。 拟除虫菊酯类农药在我国已有五十多年施用历史，随着国家对有机磷、有机氯等高毒性、难降解农药的禁用，促使拟除虫菊酯类农药扩大生产和使用范围，现在拟除虫菊酯类农药占我国杀虫剂总施用面积的三分之一以上，主要是施用于棉花、果树、蔬菜以及对家庭害虫的防治。我国目前的农药残留较为突出的是蔬菜中的农药残留，东北农业大学的李雪飞等人研究吉林省长春市的 2003 2004年 9个蔬菜批发市场 8种蔬菜中的农药残留进行调查， 结果显示， 2003年，蔬菜中残留的农药主要是有机磷农药， 8种蔬菜中， 6种检出了有机磷农药， 3种蔬菜检出了拟除虫菊酯类农药； 2004年，则主要是拟除虫菊酯类农药， 8种蔬菜中， 6种检出了有机磷农药残留， 8种蔬菜均检中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 出了拟除虫菊酯类农药残留。这说明，农民施药已经从有机磷农药转向了拟除虫菊酯类农药（李雪飞， 2006）。 拟除虫菊酯类农药残留将会引起一系列的严重后果，首先过量的残留农药会抑制庄稼生长，破坏天然植被，影响整个生态系统；其次，菊酯类农药对某些非靶标生物高毒，如家蚕、蜜蜂、赤眼蜂、鱼类、沼虾、鸡等， 1997年，林小涛等人就发现，甲氰菊酯对罗氏沼虾表现为高毒； 1999年，朱鲁生 等发现，甲氰菊酯及其混合剂对鸡也表现为高毒；另外， 2002年鲁兴萌等研究发现，即使低浓度的拟除虫菊酯农药也会对一些经济昆虫造成极大的危害，如家蚕； 2001年桐乡和海宁发生的桑园中毒事件就是因拟除虫菊酯农药残留问题引起的，而且菊酯还具有在高等动物体内富集的能力，潜在危害很突出（肖红利， 2004）；再次，害虫抗药性增加，并且会引起害虫转换，导致防治成本升高；第四，据酯类农药与土壤中有机质结合，增大了土壤对各种重金属的吸附，间接引起环境重金属，影响人类健康；最后，残留农药使得蜂产品、茶叶、纺织品、蔬果等产品遭遇 绿色壁垒 ，自从我国加入 洲不断降低从我国进口的蔬果、茶叶、肉类等产品的拟除虫菊酯类农药的残留标准，严重影响了我国的出口贸易，阻碍了经济发展。 1999年出口到德国的茶叶中氰戊菊酯 ( 农药残留超标 4倍甚至到 100倍，相当数量的茶叶不能出口，同年中国茶叶所对 2000种出口的茶叶样品进行了检测，结果发现：其中氰戊菊酯超标率为 甲氰菊酯超标为 66. % ； 2000年 7月 1日起执行的国际农残留标准，我国的茶叶等农产品出口将面临更加严峻的形势； 2002年，欧盟因农残监控体系的建立和运行问题，宣布停止从我国进口蜂蜜；山东冻鸡、冻兔由于农药残留超标而失去了国际市场影响贸易经济。 实际上 ,由于农药的致癌、致畸、致突变的 三致 作用 ,残留农药对人和动物尤其是食物链的顶端人的危害最大。 2004年欧盟最新制定的有关拟除虫菊酯类茶叶中的最低检出限标准（ mg/氯氰菊酯的检出限由原来的 0.5 mg/.1 mg/中苄呋菊酯、四溴菊酯和氟胺氰菊酯的最低限低于目前检测限（陈宗 懋， 2004）。 . 研究了杀虫剂释放对海龟数量的影响表明，海龟对于杀虫剂非常敏感；另据王毓秀等的研究 , 在目前认为可能干扰内分泌的70 种化学物质中，农药占据了 40 多种。它们可降低生物的免疫能力并诱发肿瘤 ,损害神经系统等；潘小琴等做的 14 种常见农药对孕妇影响的调查表明，我们目前使用的多种农药对人类胚胎及胎儿的发育具有一定的副作用 ,而多种农药的同时使用可能发生交互作用，对胎儿发育产生不良联合效应（ 潘小琴， 1991）。英国的一项研究发现因使用羊用防腐浸液而长期接触有机磷农药会导致慢性疲劳综合症。据估计，全世界每年有 100万 500万的农民发生农药中毒事故，其中 2万例丧生（农药污染， 2007）。 决方法 对于环境中的农药残留的解决，可以采用禁用、物化方法和生物修复方法（ 1985），物化方法工程大、费用高、副作用大、易引起二次污染、而且解决不彻底，生物修复方法具有高效、安全、成本低、无二次污染、应用范围广等优势，主要有动植物修复、微生物修复、根际环境的生物降解（林冰， 2004）。 传统的农药残留的处理方法是将果蔬采后用水洗或洗涤剂进行冲洗或浸泡，一般都是利用一些农药的水溶性和热不稳定性的原理去除农 药残留，或者对水果及果菜进行去皮处理。 士学位论文 第一章 绪论 5 道自来水冲洗 308 的马拉硫磷，吕金海等报道了浸泡时间延长，拉维因对乙酰胆碱的抑制率明显降低。常改等在实验室模拟果蔬农药污染，使用不同的洗涤方法：清水浸泡、金鱼洗涤灵浸泡、沸水焯洗，考察了不同洗涤方式对甲胺磷、氧化乐果、 1605这 3种农药的去除效果，结果表明，沸水焯洗对小白菜和圆白菜上的甲胺磷的去除率分别达到 和 ，瓜果类蔬菜采用 的金鱼洗涤灵浸泡 20甲胺磷的去除率达到了 50 以上，对韭菜中的 1605残留采用 的金鱼洗涤灵浸泡 20除率达到了 化学处理方法主要有臭氧处理和次氯酸钠处理，有研究表明：农药经臭氧处理后的产物主要是醛、酮、有机酸等小分子。还有研究报道，臭氧氧化后的产物比底物更亲水，蔬菜经臭氧处理后，其表面残留的农药被分解成易溶于水的有机小分子，水冲洗便可除去，而臭氧本身则分解成氧气，不会造成二次污染。 人曾利用 40，以 1988）； 究结果表明没有毒性产物生成，次氯酸盐加入水中能产生次氯酸，次氯酸在低 此可用于果蔬表面农药残留处理。过氧乙酸、二氧化氯、双氧水也在果蔬农药残留处理中有所应用。 菌丹、伐虫眯的效能，三占米显示臭氧作用 155 、 72 、 46（陆胜民等， 2004；吕金海， 2005）。物理方法处理果蔬农药残留是一般常用的方法，但水洗或洗涤剂洗涤的效果和应用范围终究有限。化学方法处理果蔬农药残 留的方法不失为一种较好的替代方法。但是现有的研究对农药臭氧处理后产物的毒性的确定仅限于少数的几种农药有报道指出，而且次氯酸盐处理农药残留可能会生成一些粘在果蔬表面的有毒或致癌的有机氯化合物，因此化学处理的使用受到一定的限制。 农药可以通过渗透、食物链等途径进入生物体内，生物体内的一系列酶促反应和代谢过程可以将其转化为低毒或者无毒结构。土壤中一些大型土生动物 ( 如蚯蚓 ) 和水体中的某些低级水生生物能吸收和富集环境中的残留农药，并通过自身代谢作用 , 把部分农药分解成低毒或无毒产物。植物降解有机农药有二种机制： 直接吸收并在植物组织中积累非植物毒性的代谢物 , 一旦农药被吸收 , 植物可以通过木质化作用将其储藏于新的植物结构中 , 也可以通过代谢、矿化、挥发将其无毒化；植物释放的酶可使有机农药降解得非常快 , 即使植物死后其释放的酶仍可继续发挥分解作用 , 已经证实来自植物的五种酶（脱