【毕业学位论文】石油降解菌株的筛选、鉴定及其石油降解特性的初步研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 石油降解菌株的筛选、鉴定及其 石油降解特性的初步研究 学 位 申 请 人 ：阮志勇 指 导 教 师：姜瑞波 研究员 申请学位类别 ：理学硕士 专 业：微生物学 研 究 方 向：农业微生物资源 培 养 单 位：研究生院 农业资源与农业区划研究所 提交日期 2006 年 6 月 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 石油降解菌株的筛选、鉴定及其石油降解特性的初步研究 论文作者 阮志勇 指导教师姜瑞波 培养单位中国农业科学院 农业资源与农业区划研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 王云山 副研究员 硕导 中国科学院过程所 微生物学 沈德龙 副研究员 硕导 中国农科院资源区划所 微生物学 评 阅 人 胡清秀 副研究员 硕导 中国农科院资源区划所 微生物学 答辩 主席 刘杏忠 研究员 博导 中国科学院微生物所 微生物学 李 信 研究员 博导 中国农科院研究生院 微生物学 王云山 副研究员 硕导 中国科学院过程所 微生物学 田呈明 副研究员 硕导 中国林业大学 微生物学 朴春根 副研究员 硕导 中国林科院森林保护所 微生物学 答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006 年 6 月 16 日 中国农科院资源区划所 202 会议室 记 录 王海胜 I 摘 要 随着现代石油工业的发展，石油的环境污染问题越来越突出，微生物修复技术被公认为是治理石油污染的较好方法，研究发现，获得高效、广谱、稳定、适应性强的石油降解菌株以及配套治理工艺是利用该技术进行石油污染治理的关键。 本文从大港油田长期被石油污染的土壤和水体中采集样品，对土壤中原油含量和三种主要微生物类群的数量进行测定；以原油为唯一碳源，通过直接分离和富集培养分离的方法进行石油降解菌株的筛选；通过形态观察、生理生化试验、 16s 序列分析及 法对石油降解菌株进行初步鉴定；对影响降解菌株生长和降解效率的相关因素进行试验，以确定各菌株在摇瓶中的最适生长和原油降解条件；完成石油降解复合菌群的组建，对影响复合系降解效率的因素进行试验研究，通过室内对模拟石油污染土壤的降解试验评估复合系的应用效果。 试验结果如下： 1、 石油污染对大港油田土壤中微生物群落的影响显著，微生物数量的变化同原油含量有一定的相关性，由于石油污染，大港油田土壤中微生物数量普遍偏低，重度污染区的微生物数量随着含油量的增加而减少。 2、 从大港油田石油污染样品中分离得到 16 株能以原油为唯一碳源的菌株，通过筛选得到 4 株原油降解率超过 60的菌株，其中 5 和 16 对原油的降解率分别达到 高于很多目前已报道的菌株。经形态学观察、生理生化试验、16s 序列分析和 应，将 4 株降解菌初步鉴定为： 5 为 7 为 15 为 16 为目前对 一结果为微生物降解石油提供了新的信息。 3、 通过摇床试验得出 4 株石油降解菌在摇瓶中的最佳生长和原油降解条件：初始 7 8，温度为 30，摇床转速为 200浓度（ 1，最适氮源为 适磷源为 21:2） 。 4、 通过菌株组合试验， 获得一个降解效果较好的复合系 4， 7d， 对浓度为 500 该复合系在摇瓶中的最适降解条件为： 初始 89，温度为 30，摇床转速为 200浓度（ 1，最适氮源为 适磷源为 21:2） 。原油的类型影响复合系的降解效率；原油浓度低于 2000g 时对复合系的降解效率影响不大，浓度超过 2000g 后，降解效率受到一定影响，随着原油浓度的增加，复合系的降解效率逐渐降低，当浓度达到 10000g 时，原油的降解率为 不同的表面活性剂对复合系的降解率均有一定的促进作用，尤其是复合型表面活性剂的效果最明显。 4 在室内降解模拟石油污染土壤， 15d，土壤中原油（ 5000g）的降解率达到 28d，降解率提高到 表现出较好的应用前景。 关键词 石油 生物降解 复合菌群 of by s so to to a to a to in a in In of a of to of in to A to of to in of of 4 ,15 6) ( ( (16)by in is:pH of 8, 0 , 00%, as as A of a it 0% of of 00) in in is:pH of 9, 0 , 00%, as as of of of in of in 5000g) 5 录 第一章 绪论 . 2 油污染物的简介 . 石油的概念 . 石油的组成 .石油污染土壤的现状 . 土壤中石油污染物的来源 . 土壤微生物群落对石油污染的反应 . 石油在土壤中的归宿 . 石油污染物的危害 . 土壤石油污染的现状 .油污染的微生物治理 . 石油污染治理的方法 . 石油污染微生物治理的发展与现状 . 石油降解微生物的种类 . 石油污染微生物降解的机理 . 影响石油污染微生物治理的因素 .油烃含量的检测方法 . 16 重量法 . 紫外分光光度法 . 荧光分光光度法 . 红外光度法 .油污染物治理的发展方向 . 18 存在问题 . 石油降解微生物的趋势 .究目的与内容 . 18 研究目的 . 研究内容 .二章 石油污染对大港油田土壤微生物种群数量的影响 . 20 验材料与方法 . 20 要实验仪器 . 主要化学试剂 . 试验培养基 . 土壤样品 . 试验方法 .验结果与讨论 . 23 低石油污染土壤中微生物群落分析 . 高石油污染土壤中微生物群落的分析 . 长期高污染土壤中微生物群落的分析 .小结 . 30 第三章 石油降解菌株的分离、筛选及鉴定 . 32 验材料与方法 . 32 要实验仪器 . 主要试剂 . 石油污染样品 . 原油 . 培养基 . 石油降解菌株的分离 . 石油含量的测定 . 优良石油降解菌株的筛选 . 石油降解菌株的鉴定 .验结果与讨论 . 44 油最大吸收波长的确定 . 石油标准曲线的绘制 . 石油降解菌株分离结果 . 石油降解菌株的复筛结果 . 石油降解菌株鉴定结果 .结 . 56 第四章 影响菌株生长和石油降解效率相关因素的初步研究 . 57 验材料与方法 . 57 要实验仪器 . 主要培养基 . 原油 . 试验方法 . 分析方法 .验结果与讨论 . 58 株吸收波长的测定 . 菌株生长曲线的测定 . 初始 . 温度对菌株生长和石油降解效率的影响 . 盐浓度对菌株生长和石油降解效率的影响 . 通气量对菌株生长和石油降解效率的影响 . 氮源对菌株生长和石油降解效率的影响 . 磷源对菌株生长和石油降解效率的影响 .结 . 67 第五章 石油降解菌群的组建及其石油降解特性的研究 . 68 V 验材料与方法 . 68 要实验仪器 . 主要培养基 . 原油 . 试验方法 . 分析方法 .验结果 . 69 油降解复合系的组建及其原油降解效果的评价 . 影响复合系 石油降解效率相关因素的研究 .始 4 原油降解效率的影响 .度对 4 原油降解效率的影响 .气量对 4 原油降解效率的影响 .浓度对 4 原油降解效率的影响 .源对 4 原油降解效率的影响 .源对 4 原油降解效率的影响 .面活性剂对 4 原油降解效率的影响 .油浓度对 4 原油降解效率的影响 .4 对不同来源原油降解效率的研究 .间对4降解原油效率的影响 .合系 对模拟石油污染土壤的降解试验 .结 . 80 第六章 结论与建议 . 81 参考文献 . 83 致 谢 . 88 作 者 简 历 . 89 附 录 . 90 附录 1 利用紫外分光光度法测定样品中石油含量 . 90 附录 2 降解菌株基于 16s . 92 附录 3 5 种碳源名称 . 96 I 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 度变形凝胶电泳 环芳烃 石油烃含量 油降解微生物 利油田 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 第一章 绪论 油污染物的简介 石油的概念 石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类（正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃）及少量非烃化合物（硫化物、氮化物、烷烃酸类）和有机金属（钒、镍）组成的复杂混合物（ 2003） 。 原油是未经加工的石油，是地质变迁而形成的天然有机物质的积累，是天然有机物质经过地质变迁而形成的一种粘稠的黑色的或深棕色的液体或固体，天然存在于地下或海底，有刺鼻的气味，主要是氢和碳原子结合成链的化合物，由于生成条件不同，其化学组成及物理性质随产地不同而异。一般将原油按其特征分为三类：富石蜡原油、富环烷烃原油和混合原油。在日本，也将原油按含硫量来进行分类，将含硫量 2以上的原油称为高硫原油，含硫量为 1 2的原油称为中硫原油，含硫量为 1以下的原油称为低硫原油。 (王家玲， 1988) 表 油的分类（王家玲，1988） he of 目 名称 主要成分 汽油馏分 柴油馏分 煤油馏分 典型油田 富石蜡原油 石蜡系烃多 辛烷值低 十六烷值高 燃烧性好 大庆油田 富环烷烃原油 环烷烃多 辛烷值高 十六烷值低 燃烧性稍差 委内瑞拉原油 混合原油 均介于二者之间 科威特原油 原油经过提炼可生产成各种燃料、溶剂、润滑油、沥青等各种石油制品。石油制品按照沸点范围、用途可以分为四大类：轻质油（汽车使用的汽油属轻质油，主要由碳数为 4 10 的烃组成） 、中质油（柴油则属中质油，由碳数为 10 20 的烃组成） 、重质油和固体石油制品（铺马路使用的沥青属固态石油制品） 。 石油是人类最主要的能源之一（张从等， 2000） ，有现代工业血液之称，全世界大规模开采石油是从 20 世纪初开始的， 1900 年全世界消费量约 2000 万吨， 100 年来，这一数量已增长百余倍，现在每年世界石油的总产量近 30 多亿吨（李宝明， 2004） 。 石油的组成 油的元素组成 组成石油的化学元素主要是 C、 H、 O、 S、 N。在大部分石油中， C 含量为 84 87%， H 含量为 11% 14%，平均 13；两元素在石油中一般占 95 99%。剩下的 S、 N、 O 的总含量一般在 l% 4%，其中， O 含量为 一般小于 S 含量一般小于 1%，平均中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 个别情况下，在高硫石油中，这个比例可达 3 7%，如墨西哥石油含硫 N 含量一般小于 个别情况下 N 含量也很高， 如美国加利福尼亚第三系石油氮含量可达 除上述 5 种元素外，石油中还发现有其它微量元素，构成了石油的灰份，已发现的 33 种微量元素按其含量多少和常见程度列举如下：铁 (钙 (镁 (硅 (铝 (钒 (V)、镍 (铜 (锑 (锰 (锶 (钡 (硼 (B)、钴 (锌 (钼 (铅 (锡 (钠(钾 (K)、磷 ( P)、锂 (、氯 (铋 (铍 (锗 (银 (砷 (镓 (金 (钛 (铬 (镉 (这些元素近似自然界有机物的元素组成，说明石油与原始有机质存在明显的亲缘关系。在这些微量元素中，最引起石油地质学者重视的是 V、 种元素，它们含量高，分布普遍并具有成因意义。近年来，石油灰分中的 V、 量及其比值（ V/被用来确定生油岩相、油源对比以及研究油气运移等问题。 油的馏分组成（ 曾国涛等， 1990） 利用组成石油的化合物具有不同沸点的特性，加热蒸馏，将石油切割成不同沸点范围（即馏程）的若干部分，每一部分就是一个馏分。 表 原油的馏分组成 he of 馏分 中馏分 重馏分 馏分 石油气 汽油 煤油 柴油 重瓦斯油 润滑油 渣油 温度（） 530（ 500）油的组分组成 石油化合物的不同组分对有机溶剂和吸附具有选择性溶解和吸附性能，选用不同有机溶剂和吸附剂，将石油分成若干部分，每一部分就是一个组分，分别为油质、胶质、沥青质和碳质。 油质：是指石油中凡能溶解于中性有机溶剂，不被硅胶吸附，浅黄色粘性油状物。成份主要为饱和烃和一部分芳香烃。 胶质：是指石油中可溶于石油醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，能被硅胶所吸附。可分为苯胶质（用苯解吸的产物）和酒精苯胶质。前者多为芳香烃和一些含有杂原子（氧、硫、氮）的芳香烃化合物，后者主要为含杂原子的非烃化合物。轻质油中胶质含量少于 5%，重质油中胶质含量可达 20%以上。 沥青质：是指石油中不溶于石油醚和酒清，而溶于苯、三氯甲烷的沥青部分。其分子量较大，在电子显微镜下，其宏观结构呈胶状颗粒，其分子结构以稠环芳香烃和烷基侧链组成的复杂结构。 碳质：是指石油中不溶于有机溶剂的非烃化合物。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 油的化合物组成 石油中含有数百种化合物，主要由正构烷烃、异构烷烃、环烷烃、芳烃和非烃化合物及沥青质组成。 1、正构烷烃： 属饱和烃，在常温常压下， 1 4 个碳原子（ 烷烃为气态， 5 16 个碳原子（ 16）的烷烃为液态， 17 个碳原子以上（ 的高分子烷烃皆呈固态。 石油中已鉴定出的正烷烃有 别报导曾提及见到 烷烃，但大部分正烷烃碳数 构烷烃在石油中多数占 体积） ，轻质石油可达 30%以上，而重质石油可小于 15%，其含量主要取决于生成石油的原始有机质的类型（陆相原油含量多，海相原油含量少）和原油的成熟度（未成熟的石油主要含大分子量的正构烷烃；成熟的石油中主要含中分子量的正构烷烃；