【毕业学位论文】（Word原稿）AB-QTL法定位海岛棉优异纤维品质基因和抗黄萎病基因生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 定位海岛棉优异纤维品质 基因和抗黄萎病基因 of to . . of to . I 摘 要 本论文利用优异的陆地棉栽培品种中棉所 36 和海岛棉品种海 1 杂交 ，中棉所 36 为轮回亲本，构建含 个世代的回交群体，利用 离群体以 记构建连锁图谱，采用复合区间作图方法（ 纤维品质性状、产量性状和抗黄萎病性状进行 位研究，以将海岛棉优异基因导入陆地棉优异栽培品种，来拓宽陆地棉狭窄的遗传基础，为品种改良提供更丰富的资源材料。 1、种间回交各世代群体的纤维品质性状、产量性状和抗黄萎病性状的各个指标大部分符合正态分布。性状间相关分析显示纤维长度与纤维强度为正相关，而与马克隆值负相关；子指与铃重为正相关，而与衣分负相 关。衣分与纤维长度和纤维强度成负相关，而与马克隆值成正相关。本实验中的 定位现象为以上相关关系提供了遗传解释。 2、用亲本和 样 不同来源的 1123 对 物进行多态性筛选，共筛选到 357 对多态性引物，占筛选总引物的 共对 226 对引物进行群体检验，获得 239 个 记位点，其中 220 个标记位点连锁。共构建 32 个连锁群，覆盖 个连锁群平均包含 标记位点 ,标记间平均相距 中 26 个连锁群确定了对应的染色体。 3、依据 个不同世代的纤维品质数据，共定位纤维品质的 5 个性状的 38 个 中纤维长度 11 个，纤维强度 7 个，马克隆值 6 个，纤维整齐度 8 个，纤维伸长率 6 个。其中 代 13 个， 代 11 个和 代 14 个。每个 别解释 表型变异。纤维长度的 3 个 马克隆值 1 个 能在 2 个不同世代检测到。 4、 利用 个不同世代分离群体产量性状数据，共定位 19 个产量性状 释表型变异 7% 在 同一位置 3 个世代均检测到 1 个衣分 有 3 个衣分 二个世代均可以检测到，意味着这些 不同遗传背景下稳定遗传，可以用于标记辅助育种。 5、 利用 个不同世代分离群体在人工病圃和大田的黄萎病抗性数据，共定位 23 个黄萎病相关性状 别解释表型变异的 在 的一个 最近标记相距 病圃及大田的 2 个世代均能检测到，遗传效应稳定，最大能解释 表型变异，抗性基因来源于海岛棉，可以用于标记辅助选择。 关键词：陆 海回交群体 ， 维 品质 ，抗黄萎病， n TL . . to . . . . . as to of on of in be in A 123 to 1 57 26 of to 20 39 26 be 2 a 4080% of of 26 of to 38 in 1, 7, 6, 8, 6, TL of TL be in of 19 in 1, 2 , TL % of TL be on in on in of be 23 of 7 , TL of TL on be of at to be 录 摘 要 . I . 要 英文缩略表 . 一部分 引言 . 1 1 分子标记技术 . 1 子标记的特点 . 1 子标记的主要类型及其特点 . 2 制性片段长度多态性（ . 2 机扩增多态性 . 2 切片段扩增多态性（ . 3 单序列重复（ . 4 核苷酸多态性（ . 4 他分子标记技术 . 5 2 数量性状基因（ 位研究 . 5 量性状基因（ 位的方法 . 5 标记分析法（ . 6 间作图法（ . 6 合区间作图法（ . 7 于混合线性模型的 . 8 图群体 . 8 代回交 析方法（ . 9 3 棉花主要的分子标记与 位研究 . 10 花纤维品质性状研究 . 10 花品质改良现状和问题 . 10 花纤维品质性状的遗传方式 . 11 维品质 位研究 . 11 花产量性状标记研究 . 13 花黄萎病抗性研究 . 13 D 亚基因组分化 . 14 花分子标记连锁群在染色体上的定位 . 15 4 棉花品种改良的展望 . 16 第 二部分 实验报告 . 17 1 材料与方法 . 17 验材料 . 17 状调查 . 18 取 . 19 液配制 . 19 取过程 . 20 记技术 . 21 记筛选和群体扩增 . 22 型数据整理及分析 . 23 锁图谱构建和染色体定位推测 . 23 型数据统计分析 . 23 析 . 24 2 实验结果和分析 . 24 型数据分析 . 24 维品质数据基本统计分析 . 25 量相关性状数据基本统计分析 . 29 黄萎病性状基本统计分析 . 29 型性状相关分析 . 33 体内性状间相关分析 . 33 同类性状间相关分析 . 35 性状在不同世代间相关分析 . 35 记连锁图谱构建 . 38 记筛选和群体检验 . 38 锁图谱构建 . 39 锁群的染色体定位分析 . 39 记的亚基因组分布 . 47 位研究 . 48 花纤维品质性状 位 . 48 量相关性状 位 . 51 黄萎病性状 位 . 54 位的 亚基因组上的分布 . 57 3 讨论 . 58 记偏分离 . 58 D 基因组上标记和 布 . 58 维品质 析 . 59 量相关性状 析 . 60 萎病抗性 析 . 60 共定位 . 61 类性状 定位 . 61 同类性状 定位 . 62 定位与性状同步改良问题 . 63 V 同世代间 图的异同 . 63 全文结论 . 64 参考文献 . 65 致 谢 . 73 作者简历 . 74 要 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 TL 代回交 析法 复合区间作图法 六烷基三甲基溴化铵 脱氧核糖核苷酸 二胺四乙酸 简作图法 锁群 of 然比对数值 子标记辅助选择 等基因系 密度 丙烯酰胺凝胶电泳 合酶链式反应 乙烯吡咯烷酮 量性状位点 机扩增多态性 制性片段长度多态性 标记分析 核苷酸多态性 简单序列重复 合酶 羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸 羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸 羟甲基氨基甲烷 中国农业科学院硕士学位论文 引言 1 第一部分 引言 数量性状（ 同于单基因控制的质量性状，通常受多种基因和环境以复杂的方式共同作用影响，其遗传研究的复杂性要求应用足量的遗传标记来定位各个相关基因从而深入研究它们的作用和 相互关系。传统的表型标记 ,包括形态学标记 (细胞学标记 (生理生化标记 (or 同工酶标记（ 受限于其形式的局限性，数量十分有限，这在一定程度上制约了数量遗传学的研究。而新兴的 子标记直接以 态性为标记，理论上有充足的标记用于研究，直接促进了对数量性状的深入研究。而 术在分子标记上的应用使得可以对个体多态 性进行快速有效地检测 ,极大地提高了分子标记的效率。 分子标记技术的迅猛发展，使得可以将数量性状分解成像质量性状一样的孟德尔因子来分别进行研究。 在 1988 年首次使用完整的 锁图分解数量性状成不连续的孟德尔因子。这一方法成为了现在数量遗传学研究的核心思想，也是现在使用的各种主要作图方法的理论基础。 棉花是世界上最重要的纤维作物，它的遗传学和分子生物学研究落后于其他重要农作物。在棉花上 利用分子标记已构建不少陆海种间杂种连锁图谱并定位了一些数量性状位点，但是通常采用 体定位 样得到的 于背景复杂很难应用于遗传育种中，而 1996,1997）等提出的 法则可将其定位的 速应用于育种中。 以下概述当前在分子标记和 位研究理论和方法的研究进展，综述其在棉花中的主要应用，以加深对实验背景的了解。 1 分子标记技术 子标记的特点 传统的遗传标记主要是以某种类型的表型性状为基础，但分子标记，作为新兴的遗传标记，则是直接以 态性为基础，即直接标记基因型。分子标记一出现，就很快被用于解决许多生物学问题，从基 因作图到群体遗传学，到系统发生重建，到亲子鉴定等（ 2004）。这主要是因为它具有无可比拟的优越性：（ 1）不受组织和发育时期特异性限制，由于 不同组织和不同发育时期保持恒定，所以可以方便取材，而不影响个体正常生长发育；（ 2）数量众多，理论上可以标记基因组上任何变异，可构建覆盖整个基因组的饱和遗传图谱；（ 3）通常遗传上呈现中性，不影响目标性状的表达，且不受自然选择作用，便于遗传分析；（ 4）位点多态性高，存在丰富的等位变异；（ 5）某些类型分子标记表现为共显性，能够区别纯合基因型与杂合 基因型，提供完整的遗传信息。现在分子标记技术主要应用在分子连锁图谱的构建，遗传多样性与种质鉴中国农业科学院硕士学位论文 引言 2 定，基因定位和克隆，分子标记辅助选择（ 。 子标记的主要类型及其特点 由 （ 1974）创立的 制性酶切片段长度多态性）是一种以 交技术为基础的分子标记，也是出现最早至今仍普遍使用的 记。 在 1990 年提出 记技术，使用单个随机引物实现对 增，使得操作更为简便，并开始广泛应用。993)在 1993 年获得欧洲专利局专利技术，这种标记结合了 术的可靠性和术的高效。（ 1989; 1989; 1989）利用 侧保守序列设计引物以通过扩增检测多态性，最终形成 记。 顾名思义，就是 列 上的单个碱基改变，通常是在某一位点两种可能的核苷酸的更替。为了区别于突变（ 10这样的在基因组上单个碱基位点的改变要称为 须要求等位基因频率不小于。 制性片段长度多态性（ 由 （ 1974）创立的 制性酶切片段长度多态性）是一种以 交技术为基础的分子标记，也是出现最早至今仍普遍使用的 记。 （ 1978）和 (1979)等报道了与人类球蛋白相关的 记。1980 年 提出应用 建人类遗传图谱。此后很长一段时间里， 为主要的遗传标记，用于大规模构建人类等物种的遗传图谱。 主要技术原理是：限制性酶切基因组 泳分离限制性酶切片段，用标记过的特异性探针经 交后显色或显影来检测分离的条带，以酶切片段长度的多态性作为标记。多态性产生原因主要是酶切位点的突变，酶切时产生不同大小的片段；相邻酶切位点间的碱基插入或缺失同样可造成酶切长度多态性。因此， 记是 共显性标记。 优点： 交检测可靠性高；通常为共显性标记；加上分子标记本身的优点，使成为第一代被广泛应用的分子标记。 缺点：操作复杂； 交耗时长；需要预先开发特异探针；杂交需要较大量的 作为第一代分子标记， 遗传作图和 位等方面具有广泛应用，目前大多数物种的分子连锁图谱开始都是用 记构建。 机扩增多态性 在 术开始大量应用之后， 于 1988 年提出了遗传标记 该类标记通过检测扩增 长度差异揭示 态性，但其最大的缺点在于需要知道目标序列来设计扩增引物。于是 在 1990 年提出 国农业科学院硕士学位论文 引言 3 记技术（ 1990），使用单个引物实现对 机扩增，使得操作更为简便，并开始广泛应用。 记引物长度通常为 9 10 个碱基， 量在 40以上，退火温度为 36，其他与常规 应相似。因为只有合适距离内同 时具有正确方向的正向结合位点和反向结合位点时才会有可显成带的扩增条带。绝大多数情况下，多态性产生的原因是因为引物结合位点的突变造成无法形成 增，只极少情况下是因为两合适引物结合位点间序列长度的改变，因此 优点：引物没有序列特异性，不需要预先知道目标 列；应用 测的效率很高；样品 量少，可用于小量样品检测；技术简便，成本低。 缺点： 使用很低的退火温度（ 36）进行随机扩增，重复性不高，特别是不同背景下。不过可将 记转换为 序列标签位点）加以弥补，以方便合作共享。因为转换需要测序，且 记无法体现 简便优点，只有特别重要的 记才被转换。通常为显性标记，很少为共显性标记。 作为基于 第二代分子标记之一， 遗传作图、遗传多样性研究、品种纯度鉴定等方面有着广泛地应用。 切片段扩增多态性（ 993)在 1993 年获得欧洲专利局专利技术。这种标记结合了 术的可靠性和 术的高效性。因为像 样都是检测基因组酶切片段 ，与 最大区别是在检测方法上用 增代替 交，故而得名 并不是首字母缩写，因为它显示的是酶切片段的有无，而不是长度差异 （ et 1995） 。 技术原理：用两种不同的核酸内切酶双酶切消化 生两种不同的粘性末端，连接相应的两种接头（ 作为 增的模板；通过以接头和限制酶切位点为引物退火结合的靶位点来实现酶切片段的 增。通过使用延伸进酶切片段的引物实现仅对引物延伸部分与限制位点侧翼核苷酸相匹配的限制片段选择性扩增；凝胶电泳分 析扩增产物，通过放射自显影（使用放射性标记引物）或银染显带。 优点： 1）、不需要预先知道基因组序列信息，同样的酶引物组合可以应用于不同物种。 2）、可以同时检测许多限制性酶切片段，通常在变性聚丙烯酰胺凝胶上可以同时检测 50 100 条。具有其他标记无可比拟的高效性。 3）、采用的引物长度一般为 18 20 碱基长，并且可采用没有或仅 1 个选择性碱基的引物预扩增，保证 增结果稳定可靠。 4）、可用于检测相应的基因组克隆，像 ，甚至可以印迹已克隆的 段，像柯斯质粒、 隆、 而线性排列单 个克隆和构建连锁群 (et 1995)。 缺点： 专利技术，在一定程度影响了其推广应用。而在初期必须采用标记的引物，加大实验的复杂和难度，应用银染检测后发展较快。 中国农业科学院硕士学位论文 引言 4 单序列重复（ 1985,1988） 等针对 翼保守区域开发特异引物，实现对整个 点的 增。该方法在 1989 年被扩展到另一种不同的重复性 单序列重复（ （ 1989; 1989; 1989），即形成 记。 以 1称为 1989) 1991)。 物大小差异主要