第七章发酵工艺控制

.,第七章发酵工艺控制,温度、pH、氧气、二氧化碳、泡沫发酵染菌的防治与处理发酵终点的判断等,.,发酵是一种很复杂的生产过程，其好坏涉及诸多因素，如菌种的生产性能、培养基的配比、原料质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等。不论是老或新品种，都必须经过发酵研究这一阶段，以考察其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。,.,一、发酵过程的操作类型,1、分批发酵2、补料分批发酵3、连续发酵,.,1、分批发酵,是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。一次投料，一次接种，一次收获间歇培养,.,分批发酵过程一般可粗分为四期，即适应（停滞）期、对数生长期、生长稳定期和死亡期；也可细分为六期：即停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。,.,一、初级代谢的代谢变化：,初级代谢是生命细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动，其产物为初级代谢产物。菌体的生长过程显示生长史的特征。但在发酵过程中，即使是同一种菌体，由于菌体的生理状态和培养条件的不同，各期的生长长短就有所不同。生产中要求在对数期接种原因就在此。,.,初级代谢没有明显的产物形成期，产物随着菌体生长在不断的进行合成，有的与菌体的生长呈平行关系。如乳酸、醋酸几乎在同一时期出现，而氨基酸、酶、核酸的发酵过程比前者复杂，随培养基成分、碳源、温度、菌株等不同而变化。,.,二、次级代谢产物变化,次级代谢产物包括大多数的抗生素、生物碱和微生物毒素等物质。它们的发酵属于生长与产物非偶联的类型，一般分为菌体生长、产物合成和菌体自溶个阶段。,.,菌体生长阶段：接种后，菌体开始生长，直达到菌体的临界浓度。同时，营养物质进行分解代谢，不断的消耗，浓度明显减少，溶氧浓度逐渐降低到一定的水平，其中某一参数可能成为菌体生长的限制因素，使菌体生长速度减慢，积累了相当量的某些代谢中间体，原有的酶活力下降，出现了与次级代谢有关的酶，其酶解除了控制等原因，导致菌体的生理状况发生改变，菌体就从生长阶段转入产物合成阶段。这一阶段又称为菌体的生长期或发酵前期。,.,产物合成阶段：产物数量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰减。此阶段，营养物质不断被消耗，产物不断被合成。环境因素很重要，发酵条件应严格控制，方有利于产物合成。营养物质过多，菌体就进行生长繁殖，抑制产物合成，使产物量降低；如果过少，菌体就衰老，产物合成能力就下降，产量减少。这一阶段又称为产物分泌期或发酵中期。,.,菌体自溶阶段：菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，p上升，产物合成能力衰退，生产速率下降，此时应必须结束发酵，否则，影响产品的提取。这一阶段又称为菌体的自溶期或发酵后期。,.,分批发酵的优缺点：,操作简单、周期短染菌的机会减少生产过程、产品质量易掌握对基质浓度敏感的产物，用分批发酵不合适,.,2、补料分批发酵,一种介于分批培养和连续培养之间的操作方式。在进行分批培养的过程中，向反应器内加入培养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制培养过程的目的。没有输出或间歇放掉部分发酵液（半连续发酵）,.,补料分批发酵与传统分批发酵相比，优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：（1）可解除底物抑制，产物的反馈抑制和快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾；（2）可降低培养基的黏度，并尽可能地延长产物的形成时间。（3）避免培养基积累有毒代谢物。与连续发酵相比，补料分批发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。,.,2、连续发酵,连续培养或连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，使培养系统内培养液的液量维持恒定的微生物培养方式。,.,连续发酵的优缺点：,（1）可提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；（2）便于自动控制；（3）增加了染菌机会：长时间不断地向发酵系统供给无菌空气和培养基；（4）菌种发生变异的可能性较大。,.,二、发酵条件的影响及其控制,微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的控制。了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。,.,常规的发酵条件：,罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等。,表征过程性质的状态参数：pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等。间接状态参数：比生长速率、摄氧率、释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基质消耗速率和产物合成速率等。,.,在分批发酵中，当基质过量时，菌体的生长速率与营养成分的浓度无关。：菌体的生长比速Ks：半饱和常数S：限制性基质浓度max:最大比生长速度在Sks的情况下，比生长速率与基质浓度呈线性关系。,1、基质浓度对发酵的影响,.,在S10ks时，比生长速率就接近最大值。所以营养物质均存在一个上限浓度，在此浓度以内，菌体的比生长速率随浓度增加而增加，但超过此限，浓度继续增加，反而会引起生长速率下降，这种效应称基质的抑制作用。,.,在正常的情况下，可达到最大比生长速率，然而，由于代谢产物及其基质过浓，而导致抑制作用，出现比生长速率下降的趋势。e.g.G100150g/l，不出现抑制G350500g/l，多数微生物不能生长，细胞脱水。,.,就产物的形成来说，培养基过于丰富，有时会使菌体生长过旺，黏度增大，传质差，菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量大大增加，这对产物合成不利。,.,（1）碳源的种类和浓度的影响和控制碳源分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。迅速利用的碳源能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量，并分解产物（如丙酮酸），有利于菌体的生长。但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用。慢速利用的碳源为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成（如抗生素），许多药物发酵采用。例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油分别是青霉素、头孢菌素C、盐霉素、核黄素及生物碱发酵的最适碳源。因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的。在工业上，发酵培养基中常采用迅速和缓慢利用的混合碳源，来控制菌体的生长和产物的合成。,.,碳源的浓度也对发酵有影响。由于过于丰富所引起的菌体异常繁殖，对菌体的代谢和产物合成和氧的传递会产生不良影响。若产生阻遏作用的碳源用量过大，则产物的合成会受到明显的抑制。控制碳源的浓度，可采用经验法和动力学法，即在发酵过程中采用中间补科的方法来控制。,.,（2）氮源的种类和浓度的影响和控制氮源象碳源一样,也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源。迅速利用的氮源有：氨基态氮的氨基酸、硫酸铵、玉米浆。慢速利用的氮源有：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等蛋白质。,.,快速利用氮源容易被菌体所利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量。如链霉菌的竹桃霉素发酵中，采用促进菌体生长的铵盐，能刺激菌丝生长，但抗生素产量下降。缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期，提高产物的产量是有好处的。但一次投入，也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，从而缩短产物的分泌期。,.,发酵培养基一般是选用含有快速和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐和麸皮水解液、玉米浆；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉。但也有使用单一的铵盐或有机氮源(如黄豆饼粉)。为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶，在发酵过程中，补加氮源来控制浓度。,.,（3）磷酸盐浓度的影响和控制,磷是微生物生长繁殖所必需的成分，也是合成代谢产物所必需的。微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0.32-300mmol，但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1.0mmol，提高到10mmol，就明显影响其合成。,.,磷酸盐浓度在初级代谢中的要求不如次级代谢严格。对抗生素来说，常常是采用生长亚适量磷酸盐浓度，其最适浓度取决于菌种特征、培养条件、培养基的组成和来源等因素。,.,2、灭菌情况,随着灭菌温度的升高和灭菌时间的延长，养分的破坏越大。例如葡萄糖氧化酶活性会随着温度的升高和灭菌时间的延长而下降。,.,3、种子质量,接种菌龄：一般为对数生长期后期接种量：一般为5%-10%接种量大小是由菌的生长繁殖速度决定的。种子多，占优势，防止杂菌污染，但过多会使黏度增加，溶氧不足，影响产物合成。,.,4、温度对发酵的影响和及其控制,微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。,.,(1)温度对微生物生长的影响,大多数微生物在20-40的温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于20下生长速率最大，嗜中温菌在30-35左右生长，嗜热菌在50以上生长。,.,(2)温度对发酵过程的影响,温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的各种酶的影响是不同的。,.,青霉菌：生长E=34kJ/mol呼吸E=71kJ/mol产物合成E=112kJ/mol青霉素形成速率对温度最为敏感，偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。,活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响,.,(3)温度对发酵液物理性质的影响,影响氧在发酵液中的溶解度温度溶氧影响基质的分解速率如菌体对硫酸盐吸收在25时最小,.,(4)温度对生物合成方向的影响,金色链丝菌,研究发现，温度与微生物的调节机制关系密切。例如，在20时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37时更大。因此，考虑在抗生素发酵的后期降低温度，加强氨基酸的反馈抑制作用，使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从而使发酵代谢转向抗生素的合成。,.,（5）影响发酵温度的因素,发酵热,发酵热指的是发酵过程中释放出来的净热量，以J/(m3h)为单位表示。,.,生物热：生产菌在生长繁殖过程中产生的热叫生物热。营养基质被菌体分解产生大量的热能，部分用于合成高能化合物ATP，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成生物热。搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热能。,.,蒸发热：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，进行热交换，必然引起水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量。Q蒸发=G（I出-I进）辐射热：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。显热：废气因温度差异所带走的热量。,发酵热在整个发酵过程中是随时间变化的。所以，为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施在夹套或蛇管内通入冷水加以控制（小型的发酵罐，在冬季和发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。）,.,（6）最适温度的选择,所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成。对不同的菌种、不同的培养条件、不同的酶反应以及不同的生长阶段，最适温度有所不同。,.,最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。如乳酸发酵，乳链球菌最适生长温度是34C，而产酸最多的温度是30C，但发酵速度最高的温度达40C。青霉素产生菌的最适生长温度为30，但产生青霉素的最适温度是24.7。应根据发酵的不同时期，选择不同的培养温度。生长阶段选最适生长温度，在产物分泌阶段选最适生产生产温度。即变温控制。e.g青霉素变温发酵：起初5小时，维持在30C，以后降到25C培养5小时，再降到到20C培养28小时，最后又提高到25C，培养40小时，放罐。青霉素的产量比在25C恒温发酵条件下提高14.7%。,在不同的发酵阶段选择不同的温度,.,考虑培养基成分和浓度,例如，在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高温度则养分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，产量降低。,参考其它发酵条件,例如，通气条件较差的情况下，可以适当降低温度，一方面增加溶解氧浓度，另一方面降低菌体的生长速率，以弥补因通气不足而造成的代谢异常。,.,发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。,5、pH对发酵的影响和及其控制,.,（1）pH对发酵过程的影响,pH影响菌体的生长和产物的合成：（1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；（2）菌体的形态：pH值还会影响某些霉菌的形态，如细胞壁厚度、菌丝直径。（3）细胞膜的电荷状态：引起膜渗透性的变化，从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分泌（4）产物的稳定性（5）对某些生物合成途径有显著影响：pH值往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的产量和比例发生改变。,.,微生物生长和生物合成的最适pH,微生物生长：细菌（6.37.5),霉菌和酵母菌（36),放线菌（78)微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不一样，这不仅与菌种的特性有关，也取决于产物的化学性质。,.,e.g.Clostridiumacetobutylicumfenmentation:pH在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵合适的pH值。Streptomycesgrisusfermentation生产链霉素（streptomycin）:菌体生长的合适pH值为6.36.9，而合成链霉素的pH值为6.77.3。因此，应根据发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH值。在生产过程中，及时进行调节和控制合适的pH值，以满足不同阶段的需要。,.,但同一产品的合适pH值，还因菌种、培养基组成和培养条件有关。在确定合适的pH值时，还要考虑培养温度的影响，若温度不同合适的pH值也可能发生变动。,.,几种抗生素发酵的最适pH范围,.,（2）发酵过程中pH的变化,发酵过程中，由于菌种在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使pH产生一定的变化。这种变化的根源是培养基的成分和微生物的代谢特性。,.,引起培养液的pH发生波动的因素,引起pH下降的因素：1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累2）消沫油加得过多3）生理酸性物质的存在引起pH上升的因素：1）氮源过多2）生理碱性物质存在3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多,.,（3）最适pH的选择和调节,选择最适pH的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又要最大限度地使产物合成获得高的产量。,.,在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值与微生物的生长和产物的形成中3个参数的相互关系有四种情况：第一种情况是菌体的比生长速率（）和产物比生产速率（Qp）的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内（a），这种发酵过程易于控制；第二种情况是（或Qp）的最适pH值范围很窄，而Qp（或）的范围较宽（b）；第三种情况是和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的（c），第二和第三模式的发酵pH值应严格控制；第四种情况更复杂，和Qp有各自的最适pH值(d),应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。,.,合适的p值是根据实验结果来确定。将发酵培养基调节成不同的出发pH值，进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH，以分别维持出发pH值，或者利用缓冲液配制培养基以维持之。到时观察菌体生长的情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的最适pH值。以同样的方法，可测得产物合成的合适PH值。,.,考虑发酵培养基的基础配方，使之有适当的比例，使发酵过程pH的变化在适合的范围内。因为培养基中含有代谢产酸如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2SO4和产碱如NaNO3、尿素的物质以及缓冲剂如CaCO3等成分，它们在发酵过程中要影响pH的变化，特别是CaCO3能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控制pH的变化。,控制pH的方法,.,利用上述方法调节pH值的能力是有限的，如果达不到要求，可以用在发酵过程直接补加酸或碱和补枓的方式来控制，特别是补料的方式，效果比较明显。过去是直接加入酸或碱来控制，但现在常用的是以生理酸性物质(硫酸铵)和碱性物质(氨水)来控制。它们不仅可以凋节pH值，还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可以达到调节pH和补充氨氮的目的。反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加硫酸铵。,.,目前，已比较成功地采用补枓的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。这种方法，既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性（如菌浓等）等几个目的。最成功的例子就是青霉素的补枓工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围（现已实现自动化），其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25%。,.,.,氧是一种难溶于水的气体。在25，1105Pa条件下，纯氧在水中的溶解度为1.26mmol/L，空气中的氧在纯水中的溶解度更低（0.25mmol/L）。在28氧在在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25100mmol/L.h。在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。,6、溶氧对发酵的影响和及其控制,.,好氧微生物的生长和代谢活动都需要消耗氧气，它们只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。液体中的微生物只能利用溶解氧，气液界面处的微生物还能利用气相中的氧。强化气液界面也将有利于供氧。在微生物的培养过程中，应保持供氧与耗氧的平衡，满足微生物对氧的利用。,.,（1）临界氧,发酵生产中用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度。这只能在相似的条件下，在同样的温度、罐压、通气搅拌下进行比较。这种方法能反映菌的生理代谢变化和对产物合成的影响。,临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度，如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。,.,当不存在其他限制性基质时，溶解氧浓度高于临界值，细胞的比耗氧速率保持恒定；如果溶解氧浓度低于临界值，细胞的比耗氧速率就会大大下降，或者是微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降，细胞处于半厌气状态，代谢活动受到阻碍。,.,呼吸临界氧值可用尾气O2含量变化和通气量测定，也可用溶氧电极测定。,各种微生物的临界氧值：细菌和酵母：310%放线菌：530%霉菌：1015%,合成的临界氧值：考察不同溶氧浓度对生产的影响，便可求得合成的临界氧值。,注意：实际上，呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。过高的溶氧对生长可能不利。,.,（2）溶氧作为发酵异常的指标,生长过程从培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌的生长生理状况。发酵溶氧变化异常，可及时预告生产可能出现的问题。操作故障或事故中间补料是否得当污染杂菌：溶氧会反常地迅速（一般25h)跌到零，并长时间不回升。这比无菌试验发现染菌要提前几个小时。但有时会出现染菌后溶氧反而升高的现象。,.,微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸强度来表示：耗氧速率（oxygenuptakerate)：指单位体积的培养液在单位时间的耗氧量。单位为mmolO2/(Lh)，用r表示呼吸强度（respiratorystrength)：单位质量的细胞干重在单位时间的耗氧量。单位为mmolO2/(g干细胞h)，用o2表示两者的关系：,（3）溶氧的控制,需氧方面,.,式中，r摄氧率，mmolO2/(Lh)；QO2呼吸强度，mmolO2/(g菌h)；X菌浓，g/L。,若发酵液中溶氧保持不变，即供氧=需氧，则,使供需失去平衡的因子也会改变溶氧浓度。,.,在发酵工业中，耗氧对于菌体生长和产物生成之间的关系有三种类型：产物生成期的耗氧与菌体生长期的耗氧一致。产物生成期的耗氧超过菌体生长期的耗氧量。产物生成期的最适耗氧量低于菌体生长期的耗氧量。,.,影响需氧的工艺条件,.,在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面：培养基成分和补料培养基的成分和浓度显著影响耗氧；培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随着增大。,.,菌龄影响耗氧：呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧能力自然减弱。发酵条件影响耗氧：在最适条件下发酵，耗氧量大。发酵过程中，排除有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。,.,式中，dc/dt单位时间内发酵液溶氧浓度的变化mmol/(Lh)KL氧传质系数，m/h；a比表面积（m2/m3)c*氧在水中的饱和浓度，mmol/L；cL发酵液中的溶氧浓度，mmol/L。,在稳定情况下，氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递速率即氧的传质方程式为：,凡是使KLa和c*增加的因素都能使发酵供氧改善。,供氧方面,.,增加C*的办法：,在通气中掺入纯氧，提高氧分压；提高罐压,.,提高KLa(提高设备的供氧能力）的办法：,与氧传质有关的工程参数,.,影响KLa的因素搅拌：（1）增加气液接触面积（打碎气泡），增加氧传递面积。（2）使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中的停留时间。（3）增加液体的湍流程度，降低气泡周围的液膜阻力、液体主流中液体阻力、从而增加KLa值。（4）减少菌丝结团，降低细胞壁表面的液膜阻力。改善细胞对氧和营养物质的吸收，同时降低细胞周围的“废物”和“废气“的浓度，有利于微生物代谢。,.,空气的流速KLa随空气流速的增加而增大，但空气速度过大，则可使叶轮发生过载，即叶轮不能分散空气，气体不经分散而沿搅拌器缓慢运动的中心迅速上升而逸出。,.,培养液的物理性质发酵液的表面张力、粘度、离子浓度等都会影响气体的溶解度，还影响液体的湍动以及界面和液膜的阻力，因而影响传递效率。发酵液中菌丝浓度增大，表观粘度增大，通气效率下降。发酵过程中添加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改变培养液的理化性质。,.,空气分布器对通气效率的影响发酵罐中装有多孔分布器和单孔分布器，在气流速度很低时，多孔分布器有较高的通气效率。但两者的区别随着气流速度的增加而逐渐减少。可能是低气流时多孔分布器可形成更大的传递面积，而当通气量增大时，单孔分布器能更大的增加发酵液的湍动程度。,.,控制溶氧的工艺手段,改变通气速率（增大通风量）：增大KLa值。注意，过分增大通气速率会产生副作用，如泡沫生成、罐温增高等。改变搅拌速度：转速较低时，增大搅拌速度对提高溶氧浓度有明显作用；当转速很高时，再增大搅拌速度起不到调节作用，反而打碎菌丝体，使菌体自溶并减少产量。改变气体组成中的氧分压改变罐压：提高C*。不是十分有效改变发酵液的理化性质：如加消沫剂、补加无菌水、改变培养基的成分等加入传氧中间介质：一般是不溶于培养液的液体，呈乳化状态来提高气液相之间的传递。传氧中间介质有：血红蛋白、烃类碳氢化合物（煤油、石蜡等）、含氟碳化物。,.,各种溶氧控制方法的比较,.,7、二氧化碳对发酵的影响及其控制,CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指标。CO2的抑制作用影响菌体生长、形态及产物合成高浓度的CO2会影响产黄青霉的菌丝形态。大多数微生物适应低CO2浓度（0.020.04%体积分数）。当尾气CO2浓度高于4%时微生物的糖代谢与呼吸速率下降。,.,.,.,（1）CO2对细胞的作用机制：CO2主要作用在细胞膜的脂肪酸核心部位影响磷脂的亲水头部带电荷的表面及细胞膜表面上的蛋白质,当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化。这将导致膜对许多基质的运输受阻，影响了细胞膜的运输效率，使细胞处于“麻醉”状态，生长受抑制，形态发生变化。,.,（2）呼吸商与发酵的关系,呼吸商：,RQ值可以反映菌体的代谢情况，例如酵母培养过程：RQ=1糖代谢走有氧分解代谢途径，仅供生长、无产物形成；RQ1.1走EMP途径，生成乙醇；RQ=0.93生成柠檬酸；RQ0.7生成的乙醇被当作基质再利用。,.,菌体在利用不同基质时，其RQ值也不同；在抗生素发酵中在生长、维持和产物形成阶段的RQ值也不一样。,.,（3）二氧化碳浓度的控制,发酵液中CO2浓度受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小和设备规模等。值得注意的是，罐内的CO2分压是液体深度的函数。CO2浓度的控制：根据其对发酵的促进或抑制作用，通过调节通气量和搅拌速率，提高或降低其浓度。,.,8、加糖、补料对发酵的影响及其控制,分批发酵常因配方中的糖量过多造成细胞生长过旺，供氧不足。解决这个问题可在发酵过程中加糖和补料。补料的作用是及时供给菌合成产物的需要。通过补料控制可解除抑制：基质过浓的抑制、产物的反馈抑制以及分解代谢物的抑制。从而调节菌体的呼吸，以免培养过程受氧的限制。,.,（1）补料的策略：,一次性大量：操作简便，但会造成发酵液瞬时大量稀释，扰乱菌的生理代谢，难于将过程控制在最适合于生产的状态；多次少量：麻烦些，但更合理；连续流加：快速、恒速、指数和变速流加。,.,流加操作控制系统又分为有反馈控制和无反馈控制两类在反馈控制操作中：非直接法：溶氧、呼吸商、排气中的CO2、代谢产物的浓度；直接法：限制性营养物的浓度（氮源、碳源、碳氮比）（由于缺乏直接测量的传感器，此法受限制）,.,补料应注意的问题,料液配比要适当加强无菌观念经济核算，节约粮食培养基的碳、氮要平衡,.,必须选择恰当的反馈控制参数，以及了解这些参数对微生物代谢、菌体生长、基质利用以及产物形成之间的关系。采用最优的补料程序也是依赖于比生长曲线、形态、产物形成速率及发酵的初始条件等情况。,.,优化补料速度也是补料控制的一个重要环节。因为养分和前体需要维持适当的浓度，而它们则以不同速被消耗，所以，补料速度要根据微生物对营养等的消耗速度及所设定的培养液中最低维持浓度而定。,.,补料的原则：就在于控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。补料的内容和补料时机，都是根据菌的生长代谢、生物合成规律进行调节控制，但大多数都根据经验进行。经验表明，在最适补料条件下，能正确控制菌体量的增加和糖的消耗，获得较好的效果。,.,9、泡沫对发酵的影响及控制,（1）由外界引进的气流被机械地分散形成（2）由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫（3）发酵液中糖、蛋白质和代谢物等的存在起到加强或稳定泡沫的作用,泡沫产生的原因,.,（1）通气、搅拌的剧烈程度（2）培养基所用原材料性质：蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼干粉、酵母粉和糖蜜等是主要的发泡物质。培养基中蛋白质含量越多，发酵液的粘度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。另外，培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间也会影响到培养基成分的变化，从而影响培养基的起泡能力。,泡沫消长的影响因素：,.,泡沫对发酵的危害,（1）使发酵罐的装填系数减少（2）造成大量逃液，导致产物损失（3）增加了染菌的机会（4）增加了菌群的非均一性（5）消泡剂的加入给提取工序带来困难,.,发酵过程中泡沫的控制,机械消沫化学消沫（消沫剂消沫）,.,（1）机械消沫,原理：利用物理作用，靠机械的强烈振动或压力的变化促使泡沫破碎。优点：节省原材料，不会增加下游工段的负担，减少染杂菌。缺点：效率不高（作为消沫的辅助方法），不能从根本上消除泡沫成因。,.,例如：耙式消泡桨装在发酵罐的搅拌轴上，桨上的齿面略高于液面，靠轴的旋转带动来打碎泡沫，起到消泡的作用。,罐内机械消沫,.,罐内机械消沫,.,通过喷头将含气泡的培养液喷向转向板，使其破裂，然后再流回发酵罐。,罐外机械消沫,.,（2）化学消沫,化学消沫的机理：化学消沫剂是表面活性剂。一般好的消沫剂应同时具备降低液膜的机械强度和表面粘度这两种性能。常用的消沫剂（溶解度较小、分散性较差的高分子化合物）：a)天然油脂类：玉米油、豆油、菜油及猪油等b)高级醇类：十八醇、聚二醇等c)聚醚类：聚氧丙烯甘油(GP)、聚氧乙烯氧丙烯甘油（“泡敌”）(GPE)等P187d)硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物e)氟化烷烃,.,消泡剂多数是溶解度小、分散性不十分好的高分子化合物，所以在使用时，要考虑如何降低它的黏度和提高它的分散性，来增强它们的消泡效果。使用的增效方法有:a机械分散、或借助分散剂b与载体一起使用c多种消沫剂并用d利用乳化剂增强消沫剂的消沫作用,.,染菌是发酵生产中的一个致命弱点，轻者影响了生产产品的收率和产品质量，重者会导致“倒罐”，造成严重的经济损失。,目前：提高生产技术水平，尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。,三、发酵染菌的防治及处理,.,1、染菌的途径分析,种子包括进罐前菌种室阶段出问题培养基的配制和灭菌不彻底设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏连续搅拌供给无菌空气、排放多余空气多次添加消沫剂、补充培养基定时取样分析,.,2、染菌的判断和防治,镜检无菌试验一些状态参数，如溶氧变化、排气中的CO2含量等异常现象，如菌体生长不良、耗糖慢、pH值异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常延长、发酵液的粘度异常增加等,.,造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气中有杂菌、种子带菌、灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。一般，从染菌的种类可大致判断其来源P208从发酵染菌的规模分析不同染菌时间分析对抗生素发酵染菌：前期原则上可适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长，或加入某些抑制杂菌的化合物。中后期除非是噬菌体通常后果不会那么严重。,.,3、染菌的挽救或处理,（1）种子培养期染菌的处理种子受到杂菌污染后，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。同时采用备用种子。（2）发酵前期染菌的处理如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌处理后再用；否则，补充新鲜培养基，再进行灭菌处理。也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施。,.,（3）发酵中、后期染菌的处理加入适当的杀菌剂或抗生素，以抑制杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等