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安徽医科大学本科毕业论文申请学位类别： 理学学士学位 安 徽 医 科 大 学 、 本 科 毕 业 论 文小链霉菌HCCB10043 产脂肽类抗生素的鉴定及其生物合成基因簇研究The Effct of ETS-2 on multidrug resistance in Hela cells and its signaling pathway activated preliminary study学 生 姓 名： 马应亚 学 号：0821060016 所属院系专业： 基础医学院生物技术 论文实习单位： 细胞工程教研室提交论文日期： 论文答辩日期： 指导教师: 丁锐 2012年5月致 谢弹指一挥间，四年的大学生活转瞬即逝。这四年来，在学习和生活上，有很多老师和同学帮助过我，让我深深体会到集体力量的伟大。在此，特向培养和帮助过我的各位老师和同学表示最挚诚的谢意。本篇论文是在xx博士的悉心指导下，实验室其他师姐的热情关心下完成的。在此我要向x老师致以最诚挚的敬意和感谢，谢谢他在实验过程中给予的极大帮助！x老师学识渊博、思维缜密、思路清晰，不仅开拓了我的实验思维更培养了我主动学习的能力，使我受益匪浅。他为人和蔼可亲，耐心，细致。他一切以研究为重心的端正、高尚的科研态度，甘为人梯默默奉献的无私精神亦深深感动了我，教育了我。在这短暂的实习生活中x老师给了我莫大的启迪，使我学会了很多实验技能，为我以后的实验操作打下了坚实的基础，也为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。今后我必将恩师作为自己毕生学习的榜样，时刻警戒自己要做一名合格的研究探索者。 另外，我还要感谢xxx老师、xxx老师和xxx老师在我实习期间为我提供的帮助。同时还要感谢xx教研室的其他各位老师、学姐、还有我的实习同伴xx对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。 最后，再次对关心和帮助过我的老师和同学们表示衷心地感谢！目 录中文摘要3英文摘要4前言 5材料与方法7实验结果22讨论26结论26参考文献27摘要：使用高效液相色谱法分离纯化了小链霉菌HCCB10043 的重要代谢产物，获得3 个精制品；经高分辨质谱、二级质谱与氨基酸分析鉴定其分别为A21978C1、C2 和C3。菌株16S rDNA 与已知的A21978C 产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379 的同源性为99.2，系统发育分析显示两者的亲缘关系很近；经基因钓取与沉默验证，结果显示该菌株的A21978C 生物合成基因簇与玫瑰孢链霉菌报道完全相同。ABSTRACT: An HPLC method, coupled with MS data analysis and amino acid analysis, was establishedfor the separation and identification of the major metabolites from the fermentation broth of Streptomyces parvus HCCB10043. The obtained three compounds were identifi ed as A21978C1, C2 and C3. The 16S rDNA sequence of S. parvus HCCB10043 showed 99.2 identity to that of S. roseosporus NRRL11379, the known A21978C producer,and phylogenetic analysis revealed that they had very close relationship. Gene cluster for the biosynthesis of A21978C complex in S. parvus HCCB10043 was identifi ed by comparing with the reported one in S. roseosporus NRRL11379 as reference, and validated by gene in-frame deletion. The results showed that the gene clusters were same in both strains.1 仪器与试药1100 型高效液相色谱仪( 美国Agilent 公司) ；Micromass Q-TOF Premier 质谱仪( 美国Waters 公司) ；L-8900 型高速氨基酸分析仪( 日本Hitachi 公司) ；Mastercycler epgradient PCR 仪( 德国Eppendorf 公司)。萘啶酮酸( 上海生工生物工程有限公司)，安普霉素( 上海维编科贸有限公司)，使用时两者分别先配制成25和50 mg/ml 的母液，培养基中的终浓度为25 和50 g/ml。链霉菌S. sp. HCCB10043 分离自土壤，经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定为小链霉菌( S. parvus)。大肠埃希菌(Escherichia coli) ET12567/pUZ8002( 上海生物工程研究中心) ；大肠埃希菌DH5 天根生化科技( 北京) 有限公司 ；pMD19-T simple vector 宝生物工程( 大连) 有限公司 ；双功能温敏型穿梭质粒pKC1139( 上海来益生物药物研究开发中心保藏)。种子培养基/gL-1 ：葡萄糖 20，甘油 20，可溶性淀粉60，黄豆饼粉50，KH2PO4 0.2，MgSO47H2O 0.4 ；消前pH7.35。发酵培养基/gL-1 ：葡萄糖8，黄豆饼粉 22，糊精 36，Fe (NH4)2(SO4)26H2O 1 ；消前pH 7.5。MS 培养基/gL-1 ：黄豆饼粉 20，甘露醇 20，琼脂 20 ；消前pH 自然。2 方法与结果2.1 化合物1、2、3 的制备取菌株HCCB10043 接种于高氏一号培养基4，28 培养4 d，收集孢子接种于种子培养基，28 摇瓶振荡(220 r/min) 培养，46 h 后转接于发酵培养基，28 摇瓶振荡(220 r/min) 培养，4 d 后收集培养液。按文献4 方法进行粗提。以制备型液相色谱制备单体物质，条件如下：色谱柱 PhenomenexRP C18 柱(4.6 mm250 mm，5 m) ；流动相 A ：10乙腈-0.2乙酸铵缓冲液( 用冰乙酸调至pH 4.69)，B ：50乙腈-0.2乙酸铵缓冲液( 用冰乙酸调至pH 4.69)，梯度洗脱(0 15 min，AB=3070 2080) ；流速 1.5 ml/min ；柱温 35 ；进样量 30 l。制备液相色谱图见图1。收集制备液，旋蒸浓缩至干，制得化合物1、2、3 精制品。三者均为淡黄色粉末，易溶于甲醇和DMSO，不溶于氯仿。2.2 化合物1、2、3 的鉴定对精制品分别进行高分辨质谱、氨基酸分析和质谱测定( 由上海交通大学分析测试中心完成)。化合物1、2、3 的高分辨质谱图见图2。结果表明三者的精确分子量分别为1 633.737 7、1 647.759 8 和1 661.768 7，与化合物A21978C1 C3 的精确分子量相差1110-6、810-6 与310-6，确定分子式为C73H102N17O26、C74H104N17O26 和C75H106N17O264。三者的氨基酸分析结果( 图3) 显示，1、2、3的氨基酸组成完全相同，均含有门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和赖氨酸，氨基酸组成与A21978C1 C3 也完全一致6。三者的质谱分析图谱见图4。根据A21978C1 C3 的结构( 图5) 以及环脂肽类物质中内酯键优先裂解后发生双氢转移再裂解酰胺键的规律，归纳了理论推测的应有碎片离子( 见表1)。结合质谱图，可见理论上应产生的碎片离子基本上都能在图谱中找到，少量找不到的离子可能是因为MS 响应太低或者又发生了进一步的中性丢失。综合以上3 项结果， 在化合物数据库SCIFinder 和DNP 中进行检索，确证化合物1、2、3分别为A21978C1、C2 和C3。2.3 小链霉菌HCCB10043 的16S rDNA 系统发育分析利用细菌16S 通用引物16S-F(5-GCGTGCTTAACACATGCA-3) 和16S-R(5-TGTTACGACTTCGTCCCA-3)，进行PCR 扩增，反应条件为：94 预变性3 min，94 变性1 min，58 复性30 s，72 延伸l.5 min，共30 个循环；最后72 延伸10 min。PCR产物连接到pMD19-T 中进行测序( 上海英骏生物技术有限公司)。根据测序结果，通过BLAST 程序在GenBank 中进行相似性序列检索，利用CLUSTALX 进行多系列比较分析，并使用MEGA5.05 软件利用Kimura 2-parameter 模型构建系统发育树，并进行1 000 次重复的自展检验(bootstrap)。16S rDNA 序列比对结果表明， 小链霉菌HCCB10043 与小链霉菌3151、小链霉菌13647J的16S rDNA 序列相似性为99.9，而与已知的A21978C 产生菌玫瑰孢链霉菌NRRL11379 的序列相似性达到99.2。基于16S rDNA 序列的系统发育分析显示，小链霉菌HCCB10043 与玫瑰孢链霉菌NRRL11379 处于同一分支， 与小链霉菌3151、小链霉菌13647J、粪生链霉菌( S.fimicarius)NBRC13037 等菌株的亲缘关系很近。而玫瑰孢链霉菌NRRL11379 与丝状链霉菌(S. filamentosus，玫瑰孢链霉菌同义名) 菌株NBRC12767、cfcc3140 等的亲缘关系较远，而与小链霉菌的亲缘关系更近( 图6)。2.4 小链霉菌HCCB10043 中A21978C 生物合成基因簇的确认A21978C 系列化合物经非核糖体肽合成途径(non-ribosomal peptide synthesis，NRPS) 合成7，根据已报道的A21978C 生物合成基因簇序列(GenBank 登录号AY787762) 设计引物进行逐段PCR，共35 段，每段约2.8 kb。反应条件为：94 预变性3 min，94 变性1 min，58 68 复性30 s，72 延伸3 min，共30 个循环；最后72 延伸10 min。最终将所得PCR 产物按测序结果拼接得到完整的A21978C 生物合成基因簇，共89.455 kb，序列比对表明小链霉菌HCCB10043 与玫瑰孢链霉菌NRRL11379 的合成基因簇序列完全相同( 图7)。同时设计引物u1F(5-AAGCTTATGGACATGCAGTCGCAG-3)、GTTCTT CCC-3) 和引物d2F(5-GGATCCCCGGTCACCCCACAGGAGAA-3)、d2R(5-GATATCAGTTCGAGCTGCTCGG GCA-3)，分别PCR 扩增dptA1( 编码DptA 中的第一个腺苷酰化结构域) 的上、下游片段u1、d2，将其与pMD19-T 载体连接得到重组质粒pMD19-T-u1 和pMD19-T-d2。pMD19-T-u1 经Hind 和BamH 双酶切，pMD19-T-d2 经BamH 和EcoR 双酶切，回收带有相应酶切位点的u1、d2 片段，然后与经过Hind 和EcoR 双酶切的质粒pKC1139 连接得到用于敲除的重组质粒pLYDPT( 图8A)。与亲株进行接合转移8，涂布于含有萘啶酮酸和安普霉素的MS 平板，28 培养；然后挑取接合子至含安普霉素的MS 平板37 培养，获得整合子；再在不含任何抗生素的液体TSB 培养基中连续传代，获得安普霉素敏感的双交换菌株，利用引物u1F、d2R 进行PCR 验证。以小链霉菌HCCB10043 染色体为模板的PCR产物的理论大小为3 734 bp，而缺失突变株由于缺少了包含dptA1 的1 850 bp 片段，其PCR 产物的理论大小为1 884 bp，在双交换过程中还可能会产生回复突变，回复突变株的PCR 产物大小与小链霉菌HCCB10043 的PCR 产物大小相同。将最终获得的3 株dptA1 缺失突变株( 图8B) 命名为HCCB10043-dptA1，发酵验证表明，缺失突变株已不能合成A21978C 系列产物( 图8C2)。3 讨论达托霉素是一种在体外对革兰阳性菌具有较强抗菌活性的半合成脂肽类抗生素，尤其是对临床上的耐药菌株，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRSP) 及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA) 等有效。A21978C1 C3 系列化合物作为合成达托霉素的前体物质，其产生菌株的新发现具有一定的工业开发价值9。此外，继新的氨肽酶抑制剂之后，本研究采用高分辨质谱与氨基酸分析结合的方法在小链霉菌HCCB10043 代谢产物中发现并确证了A21978C 系列物质，表明该菌株具有产生多种活性物质的