内毒素光度测定法检查技术ppt课件

光度测定法BET检查技术 湛江安度斯生物有限公司2009年3月 2020 4 22 Page2 1 光度测定法方法学分类2 光度测定法原理3 动态比浊法BET4 终点比色法BET 2020 4 22 Page3 1 光度测定法方法学分类 光度测定法 定量法检测 显色法 动态浊度法 终点浊度法 动态显色法 终点显色法 比浊法 比色法 2020 4 22 Page4 2 光度测定法原理 光电转换原理光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法 当一束光线进入如下光电转换装置时 该装置将产生电流I 我们称I为透光强度 入射光 反应混合物 透射光 光电池 I 透光容器 2020 4 22 Page5 设 初始时的透光强度为Is 某时刻的透光强度为It定义1 透光度 Rt Rt It Is 初始时It Is Rt 100 Rt曲线变化趋势是由高至低 定义2 吸光度 OD OD lg It Is 初始时It Is OD 0 OD曲线变化趋势是由低至升高 选择不同的参数 Rt或OD 将得到不同变化趋势的动态曲线 2020 4 22 Page6 TAL与内毒素反应的动态曲线 Rt T曲线 以透光度 Rt 为纵座标 时间 T 为横座标 把TAL与内毒素反应引起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中 便得到该反应的动态曲线如图 Rt T 分 动态曲线 100 孕育期 反应期 结束 2020 4 22 Page7 TAL与内毒素反应的动态曲线 OD T曲线 以吸光度 OD 为纵座标 时间 T 为横座标 把TAL与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中 便得到该反应的动态曲线如图 OD T 分 动态曲线 0 孕育期 反应期 结束 2020 4 22 Page8 动态曲线的特点 把标准内毒素制备成三个浓度C1 C2 C3 C1 C2 C3 分别与TAL反应 描绘出反应的动态曲线如下图 分析动态曲线可看出 内毒素浓度越高 孕育期越短 内毒素浓度越高 反应期曲线越陡 内毒素浓度越高 进入结束期越快 2020 4 22 Page9 光度测定法BET试验的相关变量 C3 100 Rt T 分 C2 C1 相关变量 内毒素浓度 C 透光度 Rt或OD 反应时间 T 2020 4 22 Page10 1 动态法原理 固定透光度 Rt 建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线 C T曲线 用供试品的反应时间比对标准曲线 得出供试品的内毒素浓度 这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值 Rt 的时间 回归分析 Rt 预设透光度值R0 LgT b kLgC 1 建立标准曲线 2020 4 22 Page11 2 测定样品内毒素浓度 Cs 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品 S 反应 得到反应时间Ts 比对C T关系的标准曲线 可得出供试品的内毒素含量Cs 比对标准曲线 Ts T 分 Rt R0 Cs 92 2020 4 22 Page12 2 终点法原理 固定反应时间 T 建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线 C Rt曲线 用供试品的透光度比对标准曲线 得出供试品的内毒素浓度 Rt T 分 C1 C2 C3 100 R1 R2 R3 预设反应终止时间T0 Rt R3 R2 R1 C3 C2 C1 Rt b K C 回归分析 1 建立标准曲线 2020 4 22 Page13 2 测定样品内毒素浓度 Cx 用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品 X 反应 得到透光度值Rx 比对C Rt关系的标准曲线 可得出供试品的内毒素含量Cx 2020 4 22 Page14 3 动态比浊法 试验仪器及器具动态微孔平板仪或试管仪BET软件微孔平板 反应试管等 2020 4 22 Page15 英国LabKinetics公司ATi动态试管仪 96孔 湛江安度斯公司开发的BET专用软件 生物探针 2002 2020 4 22 Page16 美国CharlesRiverEndosafe便携式检测系统 PTS 美国BioTek公司超级酶标仪 ELx808IU 使用96孔微孔板 2020 4 22 Page17 LKM细菌内毒素动态试管仪制造商 英国莱伯金耐特公司 LabKineticsLtd 世界上第一台动态试管仪的生产商目前世界上销量最大的动态试管仪已经取得医疗器械许可证完善的售后服务 仪器特点 1 体积小巧 占用空间小 2 恒温性能 光学性能精密 各孔温度均在37 0 2 这是国内同类仪器无法达到的 3 配有专业的 操作简单的软件系统 2020 4 22 Page18 ELx808IU型动态酶标仪制造商 美国伯腾公司 BioTek 功能强大的细菌内毒素检测仪器丰富的面板操作及数据分析 无需电脑可独立操作可使用多个波长同时分析 2020 4 22 Page19 动态比浊法试验程序 1 器具的准备2 验证试验标准曲线的可靠性试验干扰试验3 检查法 2020 4 22 Page20 1 试验器具的准备 凡是与供试品或反应试剂接触的器具 必须经除热原处理 通常玻璃器具需经250 60分钟的干烤处理 2020 4 22 Page21 2 标准曲线的可靠性试验 试验目的验证实验室的条件是否满足BET试验的要求验证实验人员的实验技能是否满足BET试验的要求验证实验所用试剂 包括鲎试剂 内毒素标准品 BET水等 是否满足BET试验要求 1 试剂 2020 4 22 Http Page22 2020 4 22 Page23 2 反应项目 将标准内毒素制备成至少3个浓度的稀释液 相邻浓度间稀释倍数不得大于10 最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限实验前 先预热动态仪 使其达到反应温度 2020 4 22 Page24 3 溶液C的制备 E100 BET水 1 0ml 2 8ml 2 8ml 3 6ml 3 2ml CSE 混合5分钟 E10 E2 E0 25 E0 03 CSE E100 2020 4 22 Page25 4 鲎试剂的准备 取TAL1支 用砂轮在安瓿颈划痕 擦拭后从安瓿颈处折断 避免玻璃屑落入安瓿内 用刻度吸管或移液器准确吸取BET水1 25ml沿瓶壁加入安瓿内 轻轻摇匀 使内容物全部溶解 避免产生气泡 取反应试管11支 按2 0EU ml 0 25EU ml 0 03EU ml各浓度平行3管 NC平行2管标记 2020 4 22 Page26 5 软件系统的设置 进入动态仪系统软件 根据试验要求 设置相关参数 如反应时间 预设透光度值等 填写相关的实验参数 使软件进入待采集状态 2020 4 22 Page27 6 加样反应 先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中 0 1ml 管 分别将反应溶液加入各相应反应管中 一般按照从低浓度到高浓度的顺序加样 首先加阴性对照溶液 加样完成后 将每支反应管内的混合液轻轻混匀后 插入动态仪中反应 TAL 2 0EU ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 25EU ml CSE 0 1ml 0 03EU ml 0 1ml NCBET水 0 1ml 0 1ml 0 1ml 加样顺序从低浓度到高浓度 2020 4 22 Page28 在动态仪中插入反应试管后 开始数据采集 2020 4 22 Page29 7 结果判断 药典要求1 阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间2 标准曲线的相关系数 r 0 980厂家建议值3 变异系数CV 10 关于相关系数当对一组数据作线性回归分析时 以相关系数r表示其标准曲线的线性状况 即该组数据的相关状况 当r值为正时 表示该组数据呈正相关关系 r值为负时 该组数据为负相关关系 当r值的绝对值 r 1时 其标准曲线的线性最好 2020 4 22 Page30 试验完成后进行数据分析 2020 4 22 Page31 试验完成后进行数据分析 2020 4 22 Page32 试验完成后进行数据分析 E0 3125 E0 25 E2 2020 4 22 Page33 3 干扰初筛试验 目的及原理只有在无干扰情况下 样品的内毒素检测结果才是有效的 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的稀释液 计算内毒素回收率 判断供试品浓度对BET的干扰情况 2020 4 22 Page34 试验步骤 1 供试品限值的确定2 试剂的选择3 供试品最大有效稀释的计算4 反应溶液的制备5 加样及反应6 结果判断 2020 4 22 Page35 干扰初筛试验举例 供试品限值硫酸庆大霉素 100ml 瓶 5000U ml 药典要求 硫酸庆大霉素限值L 0 5EU 1000U 2020 4 22 Page36 试剂 本试验使用鲎试剂的检测范围为10 0 03EU ml 选择标准曲线浓度为2 0 25 0 03EU ml 2020 4 22 Page37 最大有效稀释倍数的计算 光度测定法中 供试品最大有效稀释倍数计算公式 MVD cL 其中 为标准曲线最低点浓度本试验 MVD 5000U mlx0 5EU 1000U 0 03EU ml 80 倍 2020 4 22 Page38 各反应溶液的制备 溶液C的制备 E100 0 4ml 3 6mlW E10 S原液 0 4ml 3 6mlW S10 备用液 溶液A的制备 E0 5 0 8ml 2 4mlW 备用液 2020 4 22 Page39 溶液B的制备 2020 4 22 Page40 加样及反应 取TAL两支 参照标准曲线可靠性试验中的方法将其复溶 复溶鲎试剂后 运行软件 使其进入待采集状态 将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起 轻轻混匀避免产生气泡 将鲎试剂液分装至20支反应试管中 0 1ml 管 将相应的溶液A B C D加至反应管中 0 1mL 管 每浓度平行2管 E0 03 E0 25 E2 溶液C 溶液D W S20 S40 S80 S20E0 25 S40E0 25 S80E0 25 溶液A 溶液A 溶液A 溶液B 溶液B 溶液B 2020 4 22 Page41 结果判断 药典要求1 阴性对照的反应时间 TD 大于标准曲线最低浓度的反应时间 T 2 标准曲线的相关系数 r 0 9803 回收率R满足 50 R 200 厂家建议值4 变异系数CV 10 回收率的计算 光度测定法试验中 在供试品检查浓度的溶液中 添加标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度 根据回收的内毒素浓度与添加的内毒素浓度的比值 回收率R 判断供试品溶液对试验的干扰程度 R的计算公式如下 2020 4 22 Http Page42 Ct 试验测出的供试品溶液的内毒素含量Cs 试验测出的加入 m标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量 m 标准曲线的中点或靠近中点的已知浓度内毒素光度测定法规定 当R在50 200 之间时 认为在此试验条件下该供试品溶液对试验无干扰 Cs Ct m R 2020 4 22 Page43 本试验结果 相关系数绝对值 r 0 9949 0 980 TD 3600s T 20倍回收率 40倍回收率 80倍回收率 试验有效 试验有效 有干扰 有干扰 无干扰 2020 4 22 Page44 4 干扰试验 根据干扰初筛试验结果 确定选择供试品的无干扰浓度选择3批供试品进行干扰验证试验溶液的制备方法与干扰初筛试验相同 有干扰 不理想 无干扰 2020 4 22 Page45 溶液的制备 A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液B为加入 m内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液D为阴性对照 2020 4 22 Page46 反应项目设置 3批样品都在同一浓度做干扰验证试验每浓度平行2管 2020 4 22 Page47 接受标准 药典要求1 阴性对照的反应时间 TD 大于标准曲线最低浓度的反应时间 T 2 标准曲线的相关系数 r 0 9803 各批样品的回收率R满足 50 R 200 厂家建议值4 变异系数CV 10 2020 4 22 Page48 5 检查法 日常检查 根据干扰试验结果 选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查各反应溶液的制备及反应项目设置与干扰试验相同 2020 4 22 Page49 结果判断 药典要求1 阴性对照的反应时间 TD 大于标准曲线最低浓度的反应时间 T 2 标准曲线的相关系数 r 0 9803 各批样品的回收率R满足 50 R 200 厂家建议值4 变异系数CV 10 若供试品溶液A所有平行管的内毒素浓度平均值乘以稀释倍数后 小于规定的内毒素限值 判供试品符合规定 否则判供试品不符合规定无复测要求 2020 4 22 Page50 4 终点比色法BET 原理当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间 T0 时 反应混合液的吸光度值 OD 与内毒素浓度 C 成正比 利用标准内毒素建立OD C的标准曲线 利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量 仪器分光光度计酶标仪37 恒温仪 2020 4 22 Page51 试验程序 1 试验准备 仪器及用具等2 确定药品的细菌内毒素限值 L 3 选择终点比色法试剂盒终点比色法鲎试剂显色基质 底物 工作标准内毒素 CSE 4 计算供试品的最大有效稀释 MVD 或最低有效浓度 MVC 5 标准曲线的可靠性试验6 干扰试验 验证 7 检查法 日常检查