第四章-生物信息的传递(下)--从mRNA到蛋白质.ppt

第四章生物信息的传递 下 从mRNA到蛋白质 内容提要 概述遗传密码 三联子tRNA的结构 功能与种类核糖体的结构与功能蛋白质合成的过程蛋白质的运转机制 翻译 指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始 按每三个核苷酸代表一个氨基酸的原则 依次合成一条多肽链的过程 蛋白质合成的场所是核糖体蛋白质合成的模板是mRNA模板与氨基酸之间的接合体是tRNA蛋白质合成的原料是20种氨基酸 一 遗传密码 三联子 一 三联子密码定义mRNA链上每三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸 这三个核苷酸就称为密码子或三联子密码 mRNA5 GCUAGUACAAAACCU3 二 三联子密码破译 核苷酸序列 氨基酸序列 三个突破性工作体外翻译系统的建立 核糖体结合技术 核酸的人工合成 核糖体结合技术 Nirenberg和Leder 核糖体结合技术以人工合成的三核苷酸如UUU UCU UGU等为模板 在含核糖体 AA tRNA的适当离子强度的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜 游离的AA tRNA因相对分子质量小能自由过膜 与模板对应的AA tRNA能与核糖体结合 结合的因为体积超过膜上的微孔而被滞留 从而把已结合到核糖体的与未结合的AA tRNA分开 若用20种AA tRNA做20组同样的实验 每组都含20种AA tRNA和各种三核苷酸 但只有一种氨基酸用14C标记 看哪一种AA tRNA被留在滤膜上 进一步分析这一组的模板是哪个三核苷酸 从模板三核苷酸与氨基酸的关系可测知该氨基酸的密码子 至1966年 20种氨基酸对应的61个密码子和三个终止密码子全部被查清 遗传密码的破译 即确定代表每种氨基酸的具体密码 三 遗传密码的性质 1 简并性由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并 degeneracy 对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子 synonymouscodon 减少了变异对生物的影响 编码某一氨基酸的密码子越多 该氨基酸在蛋白质中出现的频率就越高 Arg例外 2 普遍性与特殊性蛋白质生物合成的整套密码 从原核生物到人类都通用 已发现少数例外 如动物细胞的线粒体 植物细胞的叶绿体 线粒体与核DNA密码子使用情况的比较 3 连续性编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读 密码间既无间断也无交叉 从mRNA5 端起始密码子AUG到3 端终止密码子之间的核苷酸序列 各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链 称为开放阅读框架 openreadingframe ORF 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失 可能导致框移突变 frameshiftmutation 4 摆动性转运氨基酸的tRNA上的反密码子需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码子反向配对结合 在密码子与反密码子的配对中 前两对严格遵守碱基配对原则 第三对碱基有一定的自由度 可以 摆动 这种现象称为密码子的摆动性 变偶假说 mRNA上的密码子的第一 第二个碱基与tRNA上的反密码子相应的碱基形成强的配对 密码的专一性主要是由于这两个碱基的作用 反密码子的第一个碱基决定一个tRNA所能解读的密码子数目 当一种氨基酸是由几个不同的密码子编码时 如密码子的头2个碱基的任何一个不同时 便必须有不同的tRNA 至少要有32种tRNA来与61个密码子相结合 U 摆动配对 ModificationtoinosineallowspairingwithU C andA tRNAcontainsmodifiedbasesthatinfluenceitspairingproperties 密码子 反密码子配对的摆动现象 二 tRNA的结构 功能与种类 一 tRNA的结构1 二级结构 三叶草形 tRNA的三叶草型二级结构 1 2 3 三片叶子 反密码子环 反密码子 载运氨基酸 臂 稀有碱基 tRNA分子富含稀有碱基 为转录后加工修饰而成 多数分布在非配对区 往往G A甲基化等 DHU环 含二氢尿嘧啶 T C环 含核糖胸苷和假尿嘧啶 附加环大小不同 可用来鉴别tRNA 反密码子环是根据位于套索中央的三联反密码子命名的 受体臂3 端的最后3个碱基序列永远是CCA 最后一个碱基的3 或2 自由羟基 OH 可以被氨酰化 2 三级结构 倒 L 形氢键 次级氢键 三级氢键 二 tRNA的功能 1 解读mRNA的遗传信息2 运输的工具 运载氨基酸 tRNA有两个关键部位 3 端CCA 接受氨基酸 形成氨酰 tRNA 与mRNA结合部位 反密码子部位 tRNA凭借自身的反密码子与mRNA链上的密码子相识别 把所带氨基酸放到肽链的一定位置 tRNA在识别mRNA分子上的密码时具有接头作用 三 tRNA的种类 1 起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA称起始tRNA 其他tRNA统称为延伸tRNA 真核生物 起始密码子AUG所编码的氨基酸是Met 起始AA tRNA为Met tRNAMet 原核生物 起始密码子AUG所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身 而是甲酰甲硫氨酸 起始AA tRNA为fMet tRNAfMet 2 同工tRNA代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA 同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码 又要有某种结构上的共同性 能被相同的氨酰 tRNA合成酶识别 3 校正tRNA 校正tRNA通过改变反密码子区校正突变 无义突变 在蛋白质的结构基因中 一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子 UAG UGA UAA 使蛋白质合成提前终止 合成无功能的或无意义的多肽 这种突变就称为无义突变 错义突变 由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码子变为另一种氨基酸的密码子 这种基因突变叫错义突变 GGA 甘氨酸 AGA 精氨酸 无义突变 校正tRNA通过改变反密码子区校正无义突变 错义抑制 如某大肠杆菌细胞色氨酸合成酶中的一个甘氨酸密码子GGA突变成了精氨酸AGA的密码子 指导合成错误的多肽 甘氨酸校正tRNA的校正基因突变使其反密码子从CCU变成UCU 它仍然是甘氨酸的反密码子 但不结合GGA而能与突变后的AGA相结合 把甘氨酸放到原来的位置上 校正效率越高越好 氨酰 tRNA合成酶 AA tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶 反应式如下 AA tRNA ATP AA tRNA AMP PPi包括两步反应 1 氨基酸活化生成酶 氨基酰腺苷酸复合物 AA ATP 酶 E E AA AMP PPi 2 氨酰基转移到tRNA3 末端腺苷残基的2 或3 羟基上 E AA AMP tRNA AA tRNA E AMP 蛋白质的合成主要决定于tRNA能否把正确的氨基酸放到新生多肽链的正确位置上 而这主要取决于AA tRNA合成酶是否使氨基酸与对应的tRNA相结合 不同的tRNA有不同的碱基组成和空间结构 易被特异性氨酰 tRNA合成酶所识别 怎么识别结构相似的氨基酸呢 异亮氨酸比缬氨酸多一个甲烯基团 而异亮氨酸 tRNA合成酶对异亮氨酸的亲和力比对缬氨酸大225倍 但体内缬氨酸的浓度比异亮氨酸高5倍 缬氨酸被错误渗入到异亮氨酸位点上去的机率应是1 40 但实际误差率只有约1 10000 表明存在其他重要的校正手段 科学家发现 被错误活化的缬氨酸不会被结合到tRNAIle上 而是被酶本身水解了 误差率 1 270 酶可以水解错误活化的氨基酸 Electronmicroscopicimagesofbacterialribosomesandsubunitsrevealtheirshapes PhotographskindlyprovidedbyJamesLake 三 核糖体的结构与功能 一 核糖体的结构 核糖体是由几十种蛋白质和多种核糖体RNA rRNA 所组成的亚细胞颗粒 一个细菌细胞内约有20000个核糖体 而真核细胞内可达106个 这些颗粒既可以游离状态存在于细胞内 也可与内质网结合 8 9 核糖体的结构 1 核糖体由大小两个亚基组成核糖体可解离为两个亚基 每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子 原核生物核糖体由约2 3的RNA及1 3的蛋白质组成 真核生物核糖体中RNA占3 5 蛋白质占2 5 2 核糖体蛋白 r 蛋白 几种不同生物核糖体及rRNA的组成 核糖体结构模型及原核与真核细胞核糖体大小亚基比较 电镜数据模式图 核糖体RNA组成和功能特点 1 5SrRNA细菌5SrRNA含有120个核苷酸 革兰氏阴性菌 或116个核苷酸 革兰氏阳性菌 位于50S大亚基内 两个高度保守的区域 一个区域含有保守序列CGAAC 是5SrRNA与tRNA相互识别的序列 另一个区域含有保守序列GCGCCGAAUGGUAGU 是5SrRNA与50S核糖体大亚基相互作用的位点 2 16SrRNA在蛋白质合成中起着积极的作用 它与mRNA 50S亚基和P位和A位的tRNA的反密码子直接作用 长约1475 1544个核苷酸之间 含有少量修饰碱基 位于30S小亚基内 16SrRNA的结构十分保守 3 端一段ACCUCCUUA的保守序列 与mRNA5 端翻译起始区中富含嘌呤 SD 序列互补 在靠16SrRNA3 端处还有一段与23SrRNA互补的序列 在30S与50S亚基的结合中起作用 3 23SrRNA 位于50S大亚基内 含与tRNA及5SrRNA互补序列 4 5 8SrRNA是真核生物核糖体大亚基特有的rRNA 长度为160个核苷酸 含有修饰碱基 还含有与原核生物5SrRNA中的保守序列CGAAC相同的序列 可能是与tRNA作用的识别序列 说明5 8SrRNA可能与原核生物5SrRNA有相似的功能 4 核糖体有3个tRNA结合位点 核糖体有3个tRNA结合位点 A位 新到来的氨酰 tRNA的结合位点 P位 肽酰 tRNA的结合位点 E位 延伸过程中的多肽链转移到氨酰 tRNA上释放tRNA的位点 tRNA的移动顺序 A位 P位 E位 每个tRNA结合位点横跨核糖体的大 小亚基 原核和真核生物核糖体的组成及功能核糖体亚基rRNAs蛋白RNA的特异顺序和功能细菌70S50S23S 2904b36种 L1 L36 含CGAAC和GT CG互补2 5 106D5S 120b66 RNA30S16S 1542b21种 S1 S21 16SRNA CCUCCU 和S D顺序 AGGAGG 互补哺乳动物80S60S28S 4718b49种有GAUC和T CG互补4 2 106D5S 120b60 RNA5 8S 160b40S18S 1874b33种和Capm7G结合 二 核糖体的自我组装 自我组装指进行组装所需要的全部信息来源于亚基结构中 其蛋白质和rRNA都带有规定组装过程的信息 自我组装的驱动力包括疏水性相互作用 氢键和离子相互作用 以及碱基堆叠之间的相互作用等 这个组装过程有一定的顺序 而且各组分的加入具有协同作用 即一种组分的加入加强了下一种组分的加入 三 核糖体的功能 合成蛋白质 在单个核糖体上 可划分多个功能活性中心 在蛋白质合成过程中各有专一的识别作用和功能 mRNA结合部位 小亚基结合或接受AA tRNA部位 A位 大亚基结合或接受肽基tRNA的部位 P位 大亚基E位 延伸过程中释放tRNA的位点 大亚基肽基转移部位 大亚基形成肽键的部位 转肽酶中心 大亚基此外 还有用于起始和延伸各种蛋白质因子的结合部位 大小亚基的生物学功能 小亚基 通过密码子与反密码子的配对 识别并结合模板mRNA 蛋白质合成中A位 P位 E位的一部分等 大亚基 结合多肽链 催化肽键形成 蛋白质合成中A位 P位 E位的一部分等 SizecomparisonsshowthattheribosomeislargeenoughtobindtRNAsandmRNA Thestagesofproteinsynthesis 四 蛋白质合成的过程 氨基酸的活化翻译的起始肽链的延伸肽链的终止新生多肽链的折叠与加工 一 氨基酸的活化 一般每种氨酰 tRNA合成酶对一种氨基酸专一 但可以和该种氨基酸的多个同工tRNA结合反应分两步进行 第一步反应 氨基酸 ATP E 氨基酰 AMP E PPi 第二步反应 氨基酰 AMP E tRNA 氨基酰 tRNA AMP E tRNA与酶结合的模型 tRNA 氨酰 tRNA合成酶 ATP 氨基酰 tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性 氨基酰 tRNA合成酶具有校正活性 proofreadingactivity 氨基酰 tRNA的表示方法 Ala tRNAAlaSer tRNASerMet tRNAMet 原核生物中 起始氨基酸是 起始AA tRNA是 真核生物中 起始氨基酸是 起始AA tRNA是 甲酰甲硫氨酸fMet tRNAfMet甲硫氨酸Met tRNAiMet 二 翻译的起始 原核生物 细菌 为例 所需成分 30S小亚基 50S大亚基 模板mRNA fMet tRNAfMet GTP Mg2 翻译起始因子 IF 1 IF 2 IF 3 一般 特定的mRNA的翻译效率受起始速度所决定 IF 3 IF 1 翻译起始 翻译起始复合物形成 又可被分成几步 1 核糖体大小亚基分离 2 30S小亚基通过SD序列与mRNA模板相结合 IF 3 IF 1 S D序列 IF 3 IF 1 3 在IF 2和GTP的帮助下 fMet tRNAfMet进入小亚基的P位 tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对 IF 3 IF 1 IF 2 GTP GDP Pi 4 带有tRNA mRNA和3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合 GTP水解 释放翻译起始因子 真核生物翻译起始的特点 核糖体较大 为 起始因子比较多 mRNA5 端具有m7Gppp帽子结构Met tRNAMetmRNA的5 端帽子结构和3 端polyA都参与形成翻译起始复合物 真核生物翻译起始复合物形成 区别原核生物 原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合 再与fMet tRNAfMet结合 最后与50S大亚基结合 而在真核生物中 40S小亚基首先与Met tRNAMet相结合 再与模板mRNA结合 最后与60S大亚基结合生成80S mRNA Met tRNAMet起始复合物 真核生物翻译起始复合物的形成 真核生物翻译起始复合物形成过程 肽链延伸由许多循环组成 每加一个氨基酸就是一个循环 每个循环包括 AA tRNA与核糖体结合 肽键的生成和移位 延伸因子 elongationfactor EF 原核生物 EF T EF Tu EF Ts EF G真核生物 EF 1 EF 2 三 肽链的延伸 1 AA tRNA与核糖体A位点的结合 需要消耗GTP 并需EF Tu EF Ts两种延伸因子 通过延伸因子EF Ts再生GTP 形成EF Tu GTP复合物 EF Tu GDP EF TsEF Tu Ts GDPEF Tu Ts GTPEF Tu GTP EF Ts 重新参与下一轮循环 2 肽键形成是由转肽酶 肽基转移酶催化 延长因子EF G有转位酶 translocase 活性 可结合并水解1分子GTP 促进核蛋白体向mRNA的3 侧移动 3 移位 核糖体向mRNA3 端方向移动一个密码子 P位上的tRNA脱落 核糖体沿mRNA模板 5 3 移动的同时 原处于A位带有肽链的tRNA被动转到P位 需要消耗GTP 并需EF G延伸因子 fMet fMet tRNAandmRNAmovethroughtheribosomeinthesamedirection Thestagesofproteinsynthesis 原核肽链合成终止过程 四 肽链的终止 真核生物只有一个终止因子 eRF GTP在蛋白质合成中的作用 GTP是一种变构因子 可通过结合诱使大分子形状发生变化使翻译准确ppGpp pppGpp 严格控制 反应的多效应的信号分子 严格控制 系统在原核生物中具有普遍性 Differencesbetweeneubacteriaandeukaryotes BacteriaRibosome 30S 50S 70SFewinitiationfactors IF 1 eIF1A IF 2 eIF5B IF 3 ElongationfactorsEF1A EF Tu EF1B EF Ts EF2 EF G ReleasefactorsRF 1 RF2 RF3RibosomerecyclingfactorRRFmRNAisnotcappedDirectbindingof30Sparticlenexttoinitiationcodon AUG atShine Dalgarnosequence 5 AGGAGGU 3 Translationcoupledtotranscription EukaryotesRibosome 40S 60S 80SManyinitiationfactorseIF1 eIF1A eIF2 eIF2B eIF3 eIF4A eIF4B eIF4E eIF4F eIF4G eIF4H eIF5 eIF5B eIF6ElongationfactorseEF1 eEF2ReleasefactorseRF1 eRF3MostmRNAiscappedat5 endandpolyadenylatedat3 end40Sparticleisrecruitedto5 capstructureorpoly A tailoraninternalribosomeentrysite IRES Translationisalways incytoplasmapartfromtranscription 真核细胞翻译的起始能在两种不同机制下发生 即帽依赖及内部核糖体进入位点方式 后者需通过形成复杂的RNA结构元件称为内部核糖体进入位点 片段 IRES 位于信使RNA5 端非翻译区 5 NTR 在反式作用因子存在的情况下可募集核糖体且不需帽子结构启动翻译 五 蛋白质前体的加工多肽链除需正确折叠外 还必须进行修饰 才能成为具有生理功能的蛋白质 1 N端fMet或Met的切除N端的fMet或Met往往在多肽链合成完毕之前就被切除 fMet先脱去甲酰基 新生蛋白质经蛋白酶切后变成有功能的成熟蛋白质 2 二硫键的形成两个半胱氨酸 SH二硫键mRNA中没有胱氨酸密码子 而不少蛋白质都含有二硫键 蛋白质合成后往往通过两个半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸 氧化 3 特定氨基酸的修饰磷酸化 糖基化 甲基化 乙基化 羟基化和羧基化 糖蛋白主要是蛋白质侧链上的天冬氨酸 丝氨酸 苏氨酸残基加上糖基形成的 胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸多数是羟基化的 实验证明 内质网可能是蛋白质N 糖基化的主要场所 前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图 4 切除新生肽链中非功能片段 蜂毒蛋白只有经蛋白酶水解切除N 端的22个氨基酸以后才有生物活性 该胞外蛋白酶只能特异性切割X Y2肽 其中X是丙氨酸 天门冬氨酸和谷氨酸 Y是丙氨酸或脯氨酸 蛋白质的折叠 由核糖体合成的新生肽链必须通过正确的折叠才能形成动力学和热力学稳定的三维构象 表现生物学活性或功能 单链多肽蛋白质三级结构具有活性 寡聚蛋白要组装成四级结构 才有活性和功能 至少有两类蛋白质参与体内蛋白质的折叠过程 加速蛋白质折叠过程酶 蛋白质二硫键异构酶 加速蛋白质正确二硫键的形成肽酰脯氨酰顺反异构酶 催化肽脯氨酰之间的肽键的旋转反应 多肽链中肽酰 脯氨酸间的肽键有顺反两种异构体 空间构象明显差别 肽酰 脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换 分子伴侣 在细胞内帮助新生肽链正确组装 成为成熟蛋白质 而本身不是最终功能蛋白质的组成成分的分子 细胞内至少有二类分子伴侣家族 热休克蛋白 包括HSP70 HSP40 GrpE三个家族 广泛存在于原核及真核细胞中 三者协同作用 促使某些自发折叠的蛋白质正确折叠 伴侣素 包括HSP60 HSP10 主要为非自发折叠蛋白提供能折叠形成天然结构的微环境 分子伴侣在新生肽链折叠中主要通过防止或消除肽链的错误折叠 增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用 六 蛋白质合成抑制剂 原核生物 嘌呤霉素 链霉素 四环素 氯霉素 红霉素等 真核生物 白喉毒素 志贺毒素 蓖麻蛋白等 几种常见蛋白质合成抑制剂的结构式 四环素族 7 五 蛋白质的转运机制 若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的 则属于翻译转运同步机制 若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转 则属于翻译后转运机制 这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞的膜结构的相互关系 蛋白质的两种转运方式 1 翻译 转运同步机制 信号肽假说信号肽 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N 末端氨基酸序列 有时不一定在N端 信号肽的特点 1 一般带有10 15个疏水氨基酸 2 在靠近该序列N 端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸 3 在其C 末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸 离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链 丙氨酸或甘氨酸 碱性氨基酸N 端 信号肽序列 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号 主要为N末端有一段保守的编码疏水性氨基酸序列 可以指导新形成的蛋白质去各自合适的位置 信号肽的一级结构 分泌蛋白的核糖体翻译进行到50 70个氨基酸残基时 信号肽从核糖体的大亚基上露出 与粗糙内质网膜上的受体结合 信号肽过膜后被水解 新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂 一旦核糖体移到mRNA的 终止 密码子 蛋白质合成即告完成 翻译体系解散 膜上的蛋白孔道消失 信号肽假说内容 信号肽在蛋白质运输过程中如何起作用 完整的信号肽是保证蛋白质转运的必要条件 仅有信号肽还不足以保证蛋白质转运的发生 信号序列的切除并不是运转所必需的 并非所有的转运蛋白都有可降解的信号肽 SRP 信号识别蛋白 能同时识别需要通过内质网膜进行运转的新生肽和自由核糖体 并导致该多肽合成的暂时终止 此时新生肽一般长约70个残基左右 SRP 信号肽 核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP的受体 DP 停靠蛋白 又称受体蛋白 相结合 SRP和DP介导了蛋白质的跨膜转运过程 只有当SRP与DP相结合时 多肽合成才恢复进行 信号肽部分通过膜上的核糖体受体及蛋白运转复合物跨膜进入内质网内腔 新生肽链重新开始延伸 SRP与DP的结合导致受体聚集而形成膜孔道 使信号肽及与其相连的新生肽得以通过 新生蛋白质通过同步运转途径进入内质网内腔的主要过程 1 线粒体蛋白质跨膜转运 2 翻译后转运机制 蛋白质运转之前多数以前体形式存在 由成熟蛋白质和位于N端的20 80个残基的前导肽 leaderpeptide 组成 是一种需能过程 首先由外膜上的Tom 外膜转运体 受体复合蛋白识别与Hsp70 热休克蛋白 或MSF 线粒体输入刺激因子 等分子伴侣相结合的待运转多肽 通过Tom和Tim 内膜转运体 组成的膜通道进入线粒体内腔 线粒体蛋白质跨膜运转 前导肽的作用与性质带正电荷的碱性氨基酸 特别是精氨酸 含量较为丰富 分散于不带电荷的氨基酸序列之间 缺少带负电荷的酸性氨基酸 羟基氨基酸含量较高 有形成两亲 既有亲水又有疏水部分 螺旋结构的能力 2 叶绿体蛋白质的跨膜运转 叶绿体定位信号肽分两个部分 决定该蛋白质能否进入叶绿体基质 决定该蛋白能否进入叶绿体基质中的类囊体 3 核定位蛋白的运转机制 为了核蛋白的重复定位 蛋白质中的信号肽 核定位序列 NLS