载体的构建 Construction of vector

载体的构建Constructionofvector陈玉芹 转基因技术的一般实验流程 载体的功能及特性 载体 携带外源DNA进入宿主细胞的工具 一 载体的功能1 运送外源基因高效转入受体细胞2 为外源基因提供复制能力或整合能力3 为外源基因的扩增或表达提供条件二 载体应具备的条件1 具有对受体细胞的可转移性2 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3 长度尽可能小 以提高其载装能力4 具有多种单一的酶切位点5 具有合适的选择性标记 植物基因工程载体 克隆载体中间克隆载体中间载体中间表达载体植物基因工程载体卸甲载体 转化载体 一元转化载体 二元转化载体 KpnI BamHI http www restrictionmapper org 载体的构建 KpnI BamHI pKANNIBAL 双酶切 连接 转化E coil 重组质粒检测 pKANNIBAL FPS pART27 NotI单酶切 连接 转化E coil 重组质粒检测 pART KANNIBAL FPS 质粒的提取 原理质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体小 且具有超螺旋共价闭合环状的特点 从而分离质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA 方法碱裂解法 溴乙锭 氯化铯密度剃度离心法 DNA质粒释放法 羟基磷灰石柱层析法及酸酚法 分离质粒DNA的方法一般包括三个基本步骤 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 碱裂解法 在pH12 0 12 5的碱性条件下加热时 连接DNA互补链之间的氢键会断裂 但由于ccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用 互补的两条链仍然紧密地结合在一起 与此相反 线性DNA的两条链则完全分开 碱裂解法提取质粒DNA 1 培养细菌将带有pKANNIBAL的大肠杆菌接种在10ml含卡那霉素的LB培养液中 37 摇床培养12h 2 收集和裂解细菌 1 取1 5ml菌液置Eppendorf小离心管中 4 12000rpm离心1 2min 弃上清 2 加入100ul预冷的溶液I 充分混匀 吹打 溶液I 50mmol l葡萄糖25mmol lTris cl PH 8 0 10mmol lEDTA PH 8 0 注 溶液I需高压蒸气灭菌15min 贮存于4 3 加入200ul新配制的溶液 加盖后快速颠倒5次以混合内容物 勿振荡 溶液 0 2mol lNaOH 临用前用10mol l贮存液现用现稀释 1 SDS 4 加150ul冰预冷的溶液 轻轻混匀 冰浴10min 4 12000rpm离心10min 转移上清至另一新离心管中 溶液 5mol l乙酸钾60ml冰乙酸11 5ml水28 5ml 5 加入等体积的酚 氯仿 充分混匀 4 12000rpm离心10min 吸上清 6 加入0 8 1倍体积的异丙醇 放入 20 10min 4 12000rpm离心10min 弃上清 7 加入70 乙醇300 400ul 4 12000rpm离心5min 弃上清 8 吸干 加入20ul无菌水或TE缓冲液溶解 9 电泳检测 大肠杆菌感受态细胞的制备 重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定 感受态细胞 competentcells 受体细胞经过一些特殊的方法 如Cacl2 Rucl等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生变化 成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞 competentcell 大肠杆菌DH5 感受态细胞的制备 1 从新活化的E coilDH5 平板上挑取1个单菌落 或感受态细胞 接种于10mlLB液体培养基中 37 振荡培养过夜 160 170rpm 2 将1ml菌液转接到100mlLB液体培养基中 37 振荡扩大培养2h 使OD600 0 5 3 将100ml菌液转移到两个50ml的离心管中 冰浴30 40min 5 000rpm 8min 弃上清 4 用冰冷的0 1mol LCacl2以1 10V 5ml 悬浮沉淀 冰浴20min 4 5 000rpm 7min 回收细胞 在冰浴中用1 20V冰冷的0 1mol LCacl2悬浮细胞 2mlCacl2 500ul75 甘油 5 每100ul分装感受态细胞 液氮速冻 80 保存 转化 transformation 是将异源DNA分子引入一细胞株系 使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段 是基因工程等研究领域的基本实验技术 重组质粒的转化 转化方法 1 化学的方法 热击法 使用化学试剂 如CaCl 制备的感受态细胞 通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞 2 电转化法 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞 通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞 重组质粒的转化 热激法 1 冰上融化感受态细胞 2 将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞 冰浴40min 3 42 热激90s 勿摇动 4 热激后立马放置冰上1 2min 5 加400ulLB液体培养基 置摇床 37 70 100rpm1h 6 涂平板 克隆的筛选与鉴定 不同抗生素基因筛选常用的抗生素有 氨苄青霉素 卡那霉素 氯霉素 四环素 链霉素等 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养 才能较容易地筛选出转化体 即带有异源DNA分子的受体细胞 否则 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上 会出现成千上万的细菌菌落 将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒 虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖 但对于连接混合物而言 此时并不能确定哪个克隆含有插入片段 半乳糖苷酶系统筛选 蓝 白斑筛选 互补现象 因为许多载体都带有一个 半乳糖苷酶 LacZ 基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息 编码 互补肽 该肽段能与宿主编码的缺陷型 半乳糖苷酶实现基因内互补 互补 当这种载体转入可编码 半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时 在异丙基 D硫代半乳糖苷 IPTG 的诱导下 宿主可同时合成这两种肽段 虽然它们各自都没有酶活性 但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质 所以称这种现象为 互补现象 由互补产生的 半乳糖苷酶 LacZ 能够作用于生色底物5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 X gal 而产生蓝色的菌落 所以利用这个特点 在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点 当插入一个外源DNA片段时 会造成LacZ 基因的失活 破坏 互补作用 就不能产生具有活性的酶 所以 有重组质粒的菌落为白色 而没有重组质