《肿瘤相关基因》PPT课件

肿瘤相关基因 肿瘤相关基因 癌基因抑癌基因肿瘤转移基因肿瘤转移相关基因肿瘤转移抑制基因 癌基因 oncogene 病毒癌基因virusoncogene v onc 细胞癌基因cellularoncogene c onc 原癌基因proto onc 病毒癌基因virusoncogene v onc 1968年Duesberg等首次发现Rous肉瘤病毒基因组编码酪氨酸蛋白激酶基因 证实它在细胞转化中起关键作用来自病毒 因而被命名为病毒癌基因 细胞癌基因cellularoncogene c onc 1972年Bishop核酸分子杂交法证实 几乎在所有高等动物细胞基因组中 都有和v onc相似的DNA序列这些序列是细胞基因组的成员之一 其编码的产物具有重要的功能细胞癌基因在正常情况下的表达有时间 空间限制 表达产物参与细胞分化 增殖 原癌基因 proto onc 未激活的细胞癌基因在人体正常细胞中存在是一种正常基因作用 调控细胞生长和分化广泛存在于生物界中 从酵母到人的细胞中都存在 原癌基因的分类 按原癌基因的结构 产物的功能 所在的位置分为下列四类 1 蛋白激酶类2 信息传递蛋白类3 生长因子及其受体类4 核内蛋白类 细胞癌基因与致癌 癌基因在生物进化中具高度保守性正常细胞中的癌基因和肿瘤细胞中的癌基因的核苷酸顺序十分相似 后者可使NIH3T3细胞恶性转化 前者需经激活后才具有转化能力说明 在正常情况下细胞癌基因不致癌 生理条件下内外环境中的某些刺激可激活癌基因 从而调节细胞的生长 分化和信息传递 通常认为 癌基因 并不是肿瘤所特有是细胞的正常基因能诱导正常细胞发生转化 并使正常细胞获得一个或多个新的生物特性的基因只有在被激活后发生异常表达时 才会导致细胞发生恶性转化 细胞癌基因的生理功能主要表现为 调节细胞生长 参与细胞分化和发育过程具有正常生理功能的同时又具有潜在致癌能力的原癌基因 其致癌潜能的发挥 首先需要被激活 常见的激活因素 病毒化学物质辐射 原癌基因的激活机理 1 DNA重排2 基因放大3 点突变4 其它调控的异常 DNA重排 插入具有高活性的启动子或增强子 使原癌基因持久 过量地表达负调控区的失活或丢失 DNA重排1插入具有高活性的启动子或增强子 使原癌基因持久 过量地表达 插入的启动子或增强子来自细胞外 外源性 如 鸡B淋巴细胞瘤由于ALV的LTR插入c myc的旁侧 5 或3 端 使c myc过量表达插入的启动子或增强子来自细胞内 内源性 如 内源性逆转录病毒的LTR 染色体易位是原癌基因DNA重排的典型例子人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因与c myc的重排 使c myc激活c myc基因定位于8q24 Ig Ig Ig 链的基因位点分别定位在14q32 2p13和22q11c myc易位到Ig位点的高活性转录区 从而组成一个高转活性的重排基因 启动c myc转录 使c myc表达增强 促进细胞恶变 最后导致肿瘤的发生 DNA重排1插入具有高活性的启动子或增强子 使原癌基因持久 过量地表达 DNA重排2负调控区的失活或丢失 小鼠c myc c fos c mos等原癌基因在旁侧顺序具有抑制转录启动的负调控区人c myc的负调控区在5 端428 1188bp处 而在B淋巴瘤中 该区有多点突变或部分丢失Duesberg提出 1号外显子被切断时 ras基因即被激活虽然这一结论还有待更多实验证实 但是 原癌基因上游或下游旁侧顺序存在负调控区 并不是个别现象 因而使原癌基因被激活的可能性大为减少 点突变 在ras基因族 在人体肿瘤中已从膀胱 小细胞肺癌 Ha ras Kit ras 胃 N ras 乳腺 Ha ras 等证明在12或61号编码子出现点突变所导致一个氨基酸的置换突变 一个氨基酸置换 可使其编码产物蛋白p21的GTPase活性明显下降 从而影响p21的生物学活性 基因放大 基因扩增 可导致基因过量表达基因放大一般被认为与恶性演进有关 未必是恶性早期的改变在人体肿瘤中 如 人肝癌中出现N ras重排及其基因放大小细胞肺癌中c myc及L myc基因放大与癌转移可能有关神经母细胞瘤中N myc基因放大明显与病程发展有关 其它调控的异常 反式 Trans 调控系统转录后的调控异常 反式 Trans 调控系统 已证明某些基因产物可影响其它基因的转录 如 病毒HTLV 中TAT LOR 区SV40中的某些片段RSV的gag区原癌基因很可能会接受其它基因 包括病毒的基因产物 的控制或影响值得注意的是 v myc进入细胞后 可关闭细胞本身c myc的表达 同时 c myc激活后亦可使另一个正常表达的c myc等位基因关闭 提示 myc产物或由myc诱导产生的物质对c myc的转录发生Trans的负控制 转录后的调控异常 成纤维细胞经生长因子处理后 结果 c myc的mRNA量增高转录水平并不改变说明 mRNA转录后加工或稳定性的改变基因的转录后调控 当前了解甚少 原癌基因的转录后调控的异常了解的更少 抑癌基因tumorsuppressorgene 肿瘤抑制基因 抗癌基因 最早由A KnudsonJr 提出细胞内一类抑制肿瘤发生 生长的基因 最近又发展为指能对抗癌基因作用的基因在生物体内与癌基因功能相抵抗 共同保持生物体内正负信号相互作用的相对稳定肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分 抗癌基因主要功能 1 诱导终末分化 2 维持基因稳定 3 触发衰老 诱导细胞程序性死亡 4 调节细胞生长 5 抑制蛋白激酶活性 6 改变DNA甲基化酶活性 7 调节组织蛋白酶活性 8 调节血管形成 9 促进细胞间联系 肿瘤细胞转移基因与转移抑制基因 肿瘤细胞转移基因的激活和 或转移抑制基因失活均可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生原发部位肿瘤组织中具有转移潜性的细胞群是肿瘤转移的细胞生物学基础 目前发现 癌基因有100多个抗癌基因有7个转移基因 metastasisgene 有一些 直接促进转移发生的关键基因 其存在或表达增强会引起侵袭转移的发生转移相关基因 metastasis asscciatedgene 有一些 只涉及转移的某个阶段 并非参与整个转移过程 目前发现 转移抑制基因 metastasissuppressorgene 有一些 Soble认为 凡是能抑制肿瘤转移的基因均可命名为转移抑制基因抑制肿瘤细胞的转移表型研究表明 肿瘤的转移与转移基因激活或转移抑制基因失活有关 是多种转移相关基因及转移抑制相关基因综合作用的结果 肿瘤相关基因的发现和深入研究的意义 提高了人们的认识细胞增殖与分化的调控机制恶性肿瘤的发生 发展规律肿瘤浸润转移机制 为肿瘤的诊断提供了崭新的途径肿瘤的发生 转移与某些特定的癌基因密切相关 对这些癌基因及其产物的检测 为肿瘤的临床诊断提供了一条崭新的途径 必将受到临床实验室技术人员和肿瘤工作者的重视 ras癌基因 参与人类肿瘤的发生发展 最初在急性转化性逆转录病毒实验中 从Harvey Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出的转化基因自82年Weinberg等人发现人膀胱癌细胞系中有活化的H ras基因后 对ras在人类肿瘤发生发展中所起的作用引起了极大关注目前研究认为 ras癌基因参与细胞生长和分化的调控参与多种肿瘤的形成与发展 ras基因家族 家族中与人类肿瘤相关的特征性基因有 H ras定位于11号染色体是大鼠肉瘤病毒的转化基因K ras定位于12号染色体是大鼠肉瘤病毒的转化基因N ras定位于1号染色体人神经母细胞瘤中分离得到 ras基因家族 ras家族的基因所共有的特征为 1 基因组中有5个外显子 4个编码的外显子和1个5 端非编码外显子2 外显子所编码的蛋白为188 189个氨基酸残基 分子量为21kD p21蛋白 此蛋白具有高度特异性和同源性 尤其在氨基酸序列的前80个氨基酸残基中 几乎无种属间差别 具有高度保守性 正常ras蛋白具有以下特点 p21 ras蛋白 位于细胞膜的内侧面 以软脂酸共价键形式固定于脂质双层膜的内表面对GTP和GDP具有高度亲和力 并具有同源性GTP酶的活性 ras蛋白 ras蛋白的生化性质与G蛋白非常类似G蛋白具有从膜结合受体到腺苷酸环化过程的信号传导作用 提示 ras蛋白可能也具有信号传导通路的作用目前 尚未发现ras蛋白作用的特异受体和靶细胞 G蛋白 G蛋白 ras蛋白 有人推测 在哺乳动物细胞中ras蛋白作用的靶分子 很可能是磷脂酶C 磷脂酶C 信号传递途径的一个重要成份 被激活后的磷脂酶CPIP2 IP3 DGIP3和DG是促进细胞增殖的第二信使现已证实 在ras癌基因转化的细胞中IP3 DG和PIP2的含量均明显多于未转化的细胞 ras基因激活机制 原癌基因的激活过程称为活化活化后的ras基因能使NIH3T3细胞系转化为肿瘤细胞ras基因活化的主要方式有 1 编码区内的突变 2 插入激活 突变激活 ras基因家族的主要激活方式 在实体瘤中占10 15 目前较公认 ras基因突变点位于三种ras基因的第12 13 59或61位氨基酸密码子Seeburg等采用定点突变技术 对H ras基因第12位密码子 甘氨酸的所有置换氨基酸的可能性进行了分析 结果表明 此位点上 除置换氨基酸为脯氨酸外 其余的置换氨基酸均具有转化潜能 但有程度差异到目前为止 在肿瘤中尚未发现二个或三个位点同时突变 插入激活 ras基因附近插入一个强启动子 promoter 或增强子 enhaner 可使ras基因表达增强 基因扩增 碱基缺失 正常基因的扩增或非编码外显子的缺失也能使ras基因呈高表达但这两种方式在ras基因激活中较少见 ras蛋白 目前认为 两种形式活化非活化通常情况下 细胞内的ras蛋白分子处于非活化状态 非活化状态下的ras蛋白特征 具有GTP酶活性能够与GDP结合当ras蛋白受到信号传递通道上游某一外界因子的刺激时 使GDP磷酸化变成GTP 随后ras蛋白发生构象改变 成为活化状态活化的ras蛋白与效应分子相互作用 实现生长信号的传递 而且这种作用发生 活化的ras蛋白会迅速失活 转变为与GDP结合的非活化形式此过程主要是ras蛋白自身的GTP酶作用 它能催化GTP水解 使活化ras蛋白能立即转变成为非活化状态的ras蛋白 活化的ras蛋白的生化性质 ras基因的任何突变使正常的ras蛋白转变为能够使NIH3T3细胞转化的蛋白 从生化角度上讲 这种突变激活可分为二种 1 突变失去内在的GTP酶活性 2 突变改变了对GDP和GTP的亲和力ras蛋白功能取决于编码蛋白的基因序列和与之密切相关的结构域突变激活的常见位点多集中在GTP GDP结合的domain附近结构的改变导致了ras蛋白的功能异常 ras基因的突变 ras基因的突变 扰乱正常状态下活化与非活化ras蛋白的这种平衡机制 使正常非活化的ras蛋白转变成活化形式实际上 ras基因的12 13 61位密码子的活化突变 并不影响p21蛋白与GDP和GTP的结合 但却降低了p21蛋白自身GTP酶活性 使其水解GTP的速效大为降低 从而使ras蛋白维持于活化状态 不断激活靶分子 引起信号传导的持续效应 导致细胞大量增殖 而发生恶性转化 理论上ras蛋白维持于活化状态有三种可能机制 1 ras蛋白自身GTP酶活性降低 使GTP水解减少 2 GDP与GTP间的交换增加 3 诱导了不需与鸟苷酸结合的ras蛋白的活化构象有人推测 ras蛋白的调节机制可能与其本身所具有的一种 开放 关闭 构型有关 构型处于 开放 时 能活跃地传导特定的生长信号 而 关闭 时则不能传导 如关键位点 12 13或61位密码子 发生了点突变 则使这种构型的开关不能再回转到闭合状态 使活化的ras蛋白持续传导一种不适当的生长信号 ras基因与人类肿瘤 82年以来 在膀胱癌 乳腺癌 结肠癌 肾癌 肝癌 肺癌 胰腺癌 胃癌 及造血系肿统瘤中 均检出了ras癌基因的异常Pulciani等人研究表明 被检肿瘤DNA中所含活化ras基因仅占10 20 似乎ras癌基因在人类肿瘤发生发展中并非起主要作用 事实上 ras癌基因参与多种肿瘤的发生发展 只不过突变率相差很大 ras基因与人类肿瘤 不同肿瘤类型 ras基因的突变率相差明显 如 最高的是在胰腺癌中 90 其次是甲状腺癌 53 和结肠癌 47 突变ras基因的种类与某些肿病类型密切相关 即有优势激活现象 如胰腺癌 结肠癌 肺癌等以K ras突变为主 造血系统肿瘤多发现N ras的突变 泌尿系肿瘤则以H ras突变为主 ras基因与人类肿瘤 目前的资料表明H ras和K ras的表达不仅与膀胱癌 肾盂癌 肺癌 结肠癌有密切的关系 而且也与胆囊癌 胰腺癌 肾母细胞癌 慢性淋巴细胞白血病 黑色素瘤形成密切相关N ras表达水平上升主要发生在造血系统的恶性肿瘤中 如APL AML BL 但在神经母细胞瘤 纤维肉瘤 横纹肌肉瘤中的表达也有一定的上升 并认为是这些肿瘤形成的主要原因检测ras突变对了解肿瘤的发生发展 以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义 c myc癌基因 c myc基因是myc基因家族的重要成员之一c myc基因是一种可易位基因是一种多种物质调节的可调节基因是一种可使细胞无限增殖 促进细胞分裂的基因myc基因参与细胞凋亡 c myc基因与多种肿瘤发生发展有关 人c myc基因 定位于8q24 Ig Ig Ig 链的基因位点分别定位在14q32 2p13和22q11c myc易位到Ig位点的高活性转录区 从而组成一个高转活性的重排基因 启动c myc转录 使c myc表达增强 促进细胞恶变 最后导致肿瘤的发生 c myc癌基因结构 c myc与禽类髓细胞病毒 AMN MC 29的v myc同源c myc基因由3个外显子及2个内含子组成第一个外显子不编码 只起调节作用只有外显子2和3与v myc相对应 编码一个439个氨基酸的蛋白质 c myc癌基因结构 c myc基因由启动子P1或P2起始转录 并在第一内含子中有一个潜在启动子P 当第一个内含子发生断裂时 P可被激活而成为一个异常转录起始点 但蛋白合成起始位点不变 并与正常c myc基因产物相同不同的动物中 c myc基因的第2 3外显子具有高度保守性 而第1外显子则有较大的差异小鼠和人的外显子1有70 的同源性 c myc癌基因的表达 c myc基因的表达与细胞的生长状态有关 生长因子刺激成纤维细胞 c myc表达增强相反 在细胞分化时c myc表达降低在细胞培养过程中 用c myc表达结构或反义寡脱氧核酸进行研究 发现c myc在细胞G0期到S期的过程中也起作用表明c myc表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关 其表达产物在调节细胞生长 分化或恶性转化中发挥作用 c myc基因表达产物的结构与功能 c myc基因的产物为磷酸化蛋白p62分子量为 62kD由c myc基因的外显子2和3共同编码由439个氨基酸组成的蛋白质c myc基因属核蛋白基因 定位细胞核内 产物为核蛋白 c myc基因表达产物的结构与功能 具有转化细胞的能力具有与染色体DNA结合的特性在调节细胞生长 分化及恶性转化中发挥作用c myc蛋白在结构上可分为 转录激活区 非特异DNA结合区 核靶序列 碱性区 螺旋 环 螺旋 HLH 及亮氨酸拉链区 螺旋 环 螺旋 HLH 亮氨酸拉链 leuzipper c myc基因表达产物的结构与功能 在c myc蛋白中 螺旋 环 螺旋紧随着碱性区 揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用在以原核生物为实验对象的研究表明 碱性区以一个自由环存在 当以特殊方式结合到DNA上时 则变成螺旋 该区是c myc蛋白与DNA特异序列的结合部位 c myc基因表达产物的结构与功能 c myc中 还存在着与抑制细胞分化 自身抑制有关的区域肿瘤转化所必需的区域Smith等研究了c myc的亮氨酸拉链区 该区介导各种转录因子的二聚作用在亮氨酸重复部位的突变能显著降低c myc抑制鼠红白血病 MEL 细胞分化能力此区的插入突变能消除c myc的转化活性认为 正是这些c myc结构成分的表达阻止了细胞进入细胞周期 从而抑制许多细胞系的分化 c myc基因表达产物的结构与功能 Cronch等对c myc亮氨酸拉链区的亮氨酸进行致突变研究发现 突变导致失去自身抑制说明 亮氨酸拉链区在自身抑制中具有重要作用 c myc基因表达产物的结构与功能 Stone等研究认为 c myc分子的中间1 3以及N 端 C 端是肿瘤转化所必需的 是c myc基因与肿瘤转化有关的区段 功能区域 c myc功能区域 促使c myc在胞浆内合成后 与其它蛋白形成寡聚体 再转移到核内 并结合到特异性的DNA序列上 从而激活和抑制许多靶基因的转录 引起细胞生长和分化的改变 发挥其生理调节功能及恶性转化作用 myc蛋白参与诱导细胞凋亡 细胞凋亡 ProgrammedCelldeath PCD 研究的深入 发现myc蛋白参与诱导细胞凋亡c myc基因表达的失调是多种细胞凋亡的主要诱因细胞发生凋亡的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于c myc蛋白的含量尚未成熟胸腺细胞中 myc基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋亡的诱因 而且在凋亡细胞的死亡阶段 也观察到c myc基因的高水平表达 如果用反义寡核苷酸阻断c myc基因的表达 则细胞凋亡受到严重干扰 myc蛋白参与诱导细胞凋亡 Evan发现 c myc表达的失调也会启动去除生长因子后培养细胞的成熟前凋亡观察了小鼠IL 3依赖性髓样细胞株32D 发现在洗去IL 3后 可立即观察到c myc基因表达下调 结果使培养细胞停止于G1期将携带c myc基因载体转染32D细胞 获得稳定表达c myc基因的32D细胞克隆 结果这种细胞去除IL 3后 不停止于G1期 而是启动以凋亡为特征的程序性细胞死亡结果揭示细胞凋亡是清除固定突变及细胞周期调控失衡的细胞的重要机制 一旦细胞发生障碍 c myc基因会启动凋亡程序 相反 则导致肿瘤形成 myc癌基因与人类肿瘤 myc基因定位于染色体8q24Ig Ig Ig 链的基因位点分别在14q32 2p13和22q11在BL中 c myc基因位点与Ig基因位点之间的易位 即c myc易位到Ig位点的高活性转录区 从而组成一个高转活性的重排基因 启动c myc转录 使c myc表达增强 促进细胞恶变 最后导致肿瘤的发生 myc癌基因与人类肿瘤 在不同的人体肿瘤细胞系中 已发现c myc或c myc相关序列的扩增粒细胞性白血病细胞系视网膜母细胞瘤细胞系某些神经母细胞瘤细胞系乳腺癌细胞系某些肺癌细胞系肠癌细胞系成骨肉瘤 软骨肉瘤 脊索瘤 脂肪肉瘤 横纹肌肉瘤 myc癌基因与人类肿瘤 c myc过量表达与肿瘤的早期复发有关在致瘤中 已发现ras与myc sis与myc myc与fos偶联激活 协同致瘤等许多资料表明c myc位点在所有受检的B细胞肿瘤中有重排 myc癌基因与人类肿瘤 Casares等 发现定位在8号染色体上的c myc与定位在14号染色体上的Ig重链基因有同样的14 2Kb的EcoR 酶切片段 因而认为发生了8 14易位8 14易位可能是何杰氏淋巴瘤的一个标志N myc在人神经母细胞瘤 视网膜母细胞瘤和小细胞肺癌中有扩增 扩增的程度与肿瘤的发病进程有关Schwab等报告20 的神经母细胞瘤有N myc扩增 其中大多数是侵袭性肿瘤 myc癌基因与人类肿瘤 Seeger等报告 myc基因拷贝数的多少预示疾病的进程c myc与小细胞肺癌30 的病例c myc扩增 复发病人中myc扩增者的生存期短于没有扩增的病例接受化疗的肿瘤病人易引起myc扩增myc基因扩增与其它肿瘤的关系也有许多报道目前认为胃癌 乳腺癌 结肠癌 宫颈癌 何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达 nm23基因 nm23基因是肿瘤转移抑制基因nm23编码的产物具有抑制肿瘤转移的功能nm23在分化良好的肿瘤中呈高水平表达 且nm23基因表达与淋巴结转移呈负相关 与无病生存期 整个生存期呈正相关检测nm23基因的表达高低 可以作为判断肿瘤有无转移的一个重要指标 nm23基因及表达 nm23基因 Steeg 美国国立癌症研究所 1988 等 从7个转移潜力不同的K 1735鼠黑色素瘤细胞株中用消减杂交分离克隆获得nm23基因 在低转移细胞株中的表达强度是高转移细胞株内的10倍 表明nm23基因在高转移肿瘤中表达降低人基因组中存在着两个nm23基因 即nm23 H1 和nm23 H2 定位于17q32 1 3 nm23基因及表达 nm23 H1mRNA nm23 H2mRNA 由两个完全不同的基因转录nm23 H1 nm23 H2 受两个独立的调控系统调节nm23 H1的mRNA的水平与癌细胞转移关系更密切 nm23基因及表达 nm23 H2基因与myc基因之间功能性连接nm23蛋白 转录因子Postel等研究 多肽PUF 是myc转录的重要调节物 PUF可与c myc启动子特异区域相结合Postel等 从Hela细胞克隆了PUFcDNA 发现它的核苷酸序列实际上与人nm23 H2序列一致一系列的生化及免疫学研究证明 PUF与nm23 H2蛋白的一致性 该蛋白通过与启动子序列特异地结合使mycDNA序列在体外转录 nm23基因及表达 目前认为 nm23虽然不一定是myc的转录刺激物 但至少是myc的一个重要调节基因细胞死亡时 nm23可以诱导myc的表达nm23 H1丧失 有助于细胞永生化 nm23表达产物及功能 nm23 H1和nm23 H2基因 编码由152个氨基酸所组成的17kD蛋白 nm23 H1和nm23 H2的氨基酸序列同源性达88 其氨基酸序列在疏水性和电荷性上高度保守 有94 的氨基酸组成是相同的nm23蛋白 p17 与核苷二磷酸激酶 NDPK 的氨基酸序列高度同源nm23 H1蛋白与NDPK的同源性达89 nm23 H2蛋白与NDPK的同源性达97 NDPK 是一类广泛存在的酶将5 NTP的一个磷酸基团转移到5 NDP上 使蛋白变为活性状态功能 在肿瘤的发生和发育上 至少参与两个重要作用 NDPK功能之一 微管的聚合 一方面可能使微管聚合异常而引起减数分裂时纺缍体的异常 从而导致癌细胞染色体非整倍体的形成 进而促进肿瘤的发展另一方面它可能通过影响细胞骨架而引起细胞运动 从而参与浸润转移过程和发育过程 NDPK功能之二 G蛋白介导的信号传导 在信号转导过程中 使GDP还原为GTP 从而使G蛋白激活Nm23蛋白以这种方式能调节大量的G蛋白介导的细胞信号传导反应 进而参与发育和肿瘤的发展 nm23基因与肿瘤转移 SteegPS 等 nm23基因表达与乳原癌转移和预后的关系17份肿瘤标本 原位杂交技术检测nm23mRNA含量结果 瘤细胞 来自有淋巴结转移的病人 均含有低水平的nm23mRNA瘤细胞 来自无淋巴结转移的病人 含有较高水平的nm23mRNA nm23基因与肿瘤转移 进一步 对71例原发性乳腺癌患者进行研究 nm23基因的表达 方法Northernblot免疫细胞化学的方法结果表明 nm23在分化良好的肿瘤呈高水平表达 nm23表达与淋巴转移呈负相关 与无病生存期 整个生存期呈正相关目前认为nm23基因产物 在抑制表型中起重要作用 nm23基因与肿瘤转移 nm23低表达与人胃癌的转移密切相关到目前为止 nm23已在胃癌 骨肉瘤 膀胱癌 乳腺癌 肠癌等具有转移潜能的肿瘤细胞中呈低表达在大肠癌中nm23在低表达与肿瘤状态和远距离转移紧密相关检测nm23表达程度可以判断肿瘤有无转移 对临床治疗具有普遍意义 国外已在91年开展这项常见检查 国内 mdm2癌基因 1992年 从一个含有双微体 murinedoublemimut DM 的自发转化的BALB3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因位于小鼠的第10号染色体的C1 C3区已在多种肿瘤中发现其突变与扩增 而且mdm2突变与p53突变不共存mdm2扩增与肿瘤转移密切相关目前研究表明 mdm2参与细胞基本生理过程 因此 mdm2癌基因的变化对阐明肿瘤发病机理以及转移机理具有重大意义 对临床也具有指导意义 mdm2癌基因 mdm2基因在进化上比较保守 在许多动物细胞的染色体上都有同源序列核苷酸序列己测定 由2372个碱基组成 在3 端和5 端各有数百个碱基组成的非编码区起始密码AUG从第311个碱基处开始 编码区全长1473个碱基 编码一个长度为491个氨基酸的蛋白质 mdm2基因 1992年 Momand等人 首次分离和证明了大鼠的mdm2基因产物是一种分子为90kD的蛋白质同年Baraby等人测定的分子量约95kD该蛋白质的分子量是90kD或95kD 故称为p90或p95p90是一种高度酸性的蛋白质 等电点非常低p90结构 一级结构己根据mdm2基因的核苷酸序列推测出来 高级结构的研究目前尚未见报道氨基酸序列分析发现 具有1个核定位信号和2个锌指蛋白 提示着它是一种DNA结合蛋白 可能具有转录调节作用 人mdm2基因 Oliner等人 对人mdm2基因进行了克隆 并定位于12q13 4正常情况下 人体许多器官都有mdm2mRNA 5 5kb 的表达 以骨胳肌最高在小鼠的许多器官组织中也有mdm2mRNA的表达 以睾丸 胸腺和脑中最高mdm2在哺乳动物中有如此广泛的表达 说明它在细胞的基本生理过程中有一定作用 根据对mdm2癌基因产物分析也提示 mdm2癌基因在控制细胞生长上有一定作用 mdm2癌基因的成瘤性研究 mdm2癌基因在自发转化的BALB 3T3DM细胞系有高度扩增 其扩增程度是正常的50倍以上 而且这些转化的细胞在软琼脂上可以生长 并在裸鼠皮下可以成瘤 成瘤速度非常快 在1 2周内就可以出现一个快速生长的肿瘤 mdm2癌基因的成瘤性研究 用mdm2基因 转染NIH3T3细胞和大鼠的Rat细胞 可以使转染细胞的mdm2mRNA水平增高10 15倍过度表达的程度与mdm2在这些细胞内的扩增程度有直接关系将转染的细胞接种到16只裸鼠皮下 裸鼠均发生了肿瘤 但出现肿瘤的时间要晚于3T3DM细胞 这可能与3T3DM细胞的mdm2的表达程度较高有关动物实验说明 mdm2癌基因 可以使细胞转化和具有成瘤性 并可以促进移植瘤的快速出现 mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达 1992年Oliner等首次报道mdm2癌基因在人体的软组织和骨的肉瘤中有扩增47例肉瘤中有17例扩增 7例脂肪肉瘤 7例恶性纤组织细胞瘤 3例骨肉瘤 扩增程度从5 50倍不等 在有高度扩增的肉瘤细胞中有高水平的mdm2癌基因产物p90的表达 mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达 Ladanyi等人 研究了28例骨肉瘤 16例原发 11例转移 1例局部复发 的mdm2癌基因的扩增情况 结果 4例 3例转移和1例复发 有mdm2癌基因扩增在原发性骨肉瘤中未见有mdm2癌基因的扩增Ladanyi认为mdm2癌基因的扩增可能与骨肉瘤的发展和转移有关 mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达 Reifenferger等 最近发现 mdm2癌基因在人脑肿瘤中有扩增对157例人脑肿瘤检测发现 8 10 的胶质母细胞瘤和变型星型细胞瘤有mdm2癌基因扩增扩增程度从8 70倍不等 mdm2癌基因在人类肿瘤的扩增和表达 Sheikh等发现 在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中 mdm2mRNA表达水平是雌激素受体阴性细胞系的30倍在良性软组织肿瘤 脂肪瘤 和结肠 直肠 肾 宫颈癌中未发现有mdm2癌基因的扩增 mdm2癌基因研究的展望 mdm2癌基因的研究才刚刚起步 初步的研究结果己显出来 在胶质瘤 骨肉瘤和软组织肉瘤中有一定关系在骨肉瘤中检测mdm2的扩增有可能成为一个估计预后的指标mdm2在乳腺癌细胞系中的扩增 但在胃肠道和宫颈癌中未发现有扩增在其它肿瘤的表达情况及与临床病理学特征的关系有待进一步探讨 mdm2癌基因研究的展望 mdm2癌基因表达产物在人类为p90p90可以与p53蛋白形成复合物 p90 p53 使p53失活mdm2的精确功能尚不清楚 因此它的过度表达是否可以通过其它机理 而不是通过灭活p53而促进肿瘤生长 对其表达产物的氨基酸序列分析发现 具有与DNA结合特定模序 mdm2癌基因研究的展望 mdm2基因位于12q 在这个区域还有其它两个基因sas和gil 这两个基因在一些恶肿瘤中也有扩增在胶质瘤 软组织和骨肉瘤中位于染色体同一区域的mdm2 sas和gil会不会同时扩增 扩增程度等仍是值得探讨的问题 p16基因 1994年 美国冷泉实验室Kamb等 新发现的抗癌基因又叫MTS multipletumorsuppressor1 基因是一种细胞周期中的基本基因 直接参与细胞周期的调控 负调节细胞增殖及分裂在人类50 肿瘤细胞株中发现有纯合子缺失 突变 认为p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因有人把它比作细胞周期中的刹车装置 一旦失灵则会导致细胞恶性增殖 导致恶性肿瘤发生 p16基因 在肺癌 乳腺癌 脑肿瘤 骨肿瘤 皮肤癌 膀胱癌 肾癌 卵巢癌和淋巴瘤 黑色素瘤中发现 p16基因纯合子缺失 无义 错义移码突变 表明p16基因以缺失 突变方式广泛参与肿瘤形成检测p16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后 具有十分重要的临床意义 p16基因结构及表达 p16基因定位于人染色体9p21 由2个内含子及3个外显子组成第1外显子由126bp组成第2外显子由307bp组成第3外显子由bp组成p16基因是细胞周期中的一种基本基因 其表达产物直接参与细胞增殖的负调节p16基因如何调整起始转录 其相关调节因子有哪些 如何调节 尚不清楚 p16基因的表达产物及功能 p16基因编码产物是p16蛋白 定位于细胞核内DavidBeach等证明 p16蛋白是作用于细胞分裂周期 celldivisioncycle cdc 的关键酶之一是CDK cyclin dependentkinase 的抑制因子 p16基因的表达产物及功能 cdc基因编码产物是蛋白激酶 参与调控G1 S G2 M的关键点转换控制细胞分化的机制涉及到多种组成成分 最重要的是细胞周期素 cyclin Cyclin 周期性累积与分解对细胞周期时程的调控作用CDK与cyclin复合体分别在细胞周期的不同时相发挥作用 启动DNA复制及诱发有丝分裂CDK可能是调控细胞周期装置的核心 通过对一系列关键底物磷酸化作用来调节细胞周期 Cellcycle p16基因的表达产物及功能 CDK与cyclin复合体参与G1 S转换的调控p16蛋白抑制CDK活性 最终阻止细胞进入S期p16基因 因缺失 突变等原因 功能缺失 则不能抑制CDK 最终导致细胞进入恶性增殖 加速肿瘤发生 p16基因的表达产物及功能 CDK cyclin可作用于多种癌基因产物 如 pp60c syc c abl产物 对其进行磷酸化修饰调节 CDK cyclin亦可作用于某些抗癌基因产物 如 Rb蛋白磷酸化后则生长抑制功能丧失 在G1 S交界处 CDK G1cyclin 使Rb磷酸化而失活 细胞从静止态进入增殖态可见 p16基因是一种非常重要的抗癌基因 p16基因失活 则会引起细胞恶性增殖 p16基因与肿瘤 Gianic等 定量PCR检测了32例恶性神经胶质瘤的p16外显子2发现 59 恶性神经胶质瘤中 p16基因的量有改变 根据光密度扫描 24 的病人是因p16基因纯合子缺失所致 p16基因与肿瘤 JenJ 等 PCR技术检测57例脑肿瘤p16基因发现26例出现纯合子缺失 p16基因与肿瘤 Kamb等从肺癌 乳腺癌 囊肿瘤 骨肿瘤 皮肤癌 膀胱癌 肾癌 卵巢癌 淋巴瘤等中检测出50 以上的p16基因纯合子缺失在黑色素瘤中 还检出无义错义 移码突变研究表明 p16基因参与了各种组织的肿瘤形成检测p16基因的突变与缺失 是判断肿瘤的性质及预后的一项重要指标 p16基因与肿瘤 p16基因体积小 只有p53的1 10p16基因用于基因诊疗 更易操作 对临床肿瘤治疗更具有现实意义研究p16基因正是目前及今后一段时期的热点 抗肿瘤基因的实验证据1 遗传性肿瘤中某些基因的丢失 早在70年代已经证明 某些遗传性肿瘤中染色体的某些位点可发生专一的丢失视网膜母细胞瘤的40 属先天性这些遗传性病例 大多为双侧性 的患儿 约5 可见13q14的一个等位基因位点的缺失 而且肿瘤发生时 肿瘤细胞中另一个等位基因也发生了缺失 成为纯合体提示 第一次的缺陷属先天性 第二次属体细胞突变 A Kmudson 提出了 两次突变 学说 只有两个等位基因同时缺失时才发生视网膜母细胞瘤 因此这种抗视网膜母细胞瘤的原癌基因 Rb基因 具有显著性的意义根据酯酶D的测定和与染色体13有关的限制性内切片段长并多态性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 证明 至少50 的视网膜母细胞瘤细胞中存在纯合体的13q14 20缺失经治疗后痊愈的儿童 以后易患肉瘤 而这种瘤细胞中也发现了13号染色体标志位点的缺失 另一个相似的例子是肾母细胞瘤 Wilm瘤 在肿瘤细胞中出现纯合子的11q13的缺失11p标记位点的缺少还与肝母细胞瘤 小儿横纹肌肉瘤 肾上腺皮须癌有关 抗肿瘤基因的实验证据2 正常和恶性细胞杂交中正常染色体对恶性行为的抑制 应用体细胞杂交技术 正常细胞与恶性细胞杂交后所形成的杂体细胞 其恶性程度降低 但随着正常染色体被逐 排斥 恶性度又恢复正常小鼠成纤维细胞和恶性转化细胞杂交后 抑制恶性生长的基因位于小鼠染色体4正常人成纤维细胞与中国仓鼠或金仓鼠恶性转化细胞杂交时 抑制恶性行为的基因分别位于染色体2或1正常人成纤维细胞和人HeLa细胞杂交时 这种 阻抑基因 位于染色体11及14不同种属 不同种类恶性细胞的抗肿瘤基因的种类不相同 抗肿瘤基因的性质和生物学意义 由于对抗肿瘤基因编码的产物尚不了解 所以目前仍难以说明抗肿瘤基因的性质和确切的生物学功能R Sager推测 抗肿瘤基因的产物包括不少抑制细胞生长的物质 其中有抑素 chalone 生长抑制因子 GIF 细胞MHC 1抗原 有助于机体免疫系统的有效识别 抗肿瘤基因可能包括 1 编码抑制细胞生长的一些物质2 基因表达的调节控制序列 包括trans调节或cis调节的负控制区3 调控基因组稳定性的某些基因以上仅仅是根据现有材料的一些推测 将有待于实验的证实 最近 有三方面的实验室结果 比较直接提供存在抗瘤基因的证据 Rb基因的分离 美国哈佛大学麻省理工学院加州大学分别分离出Rb基因的cDNA及其DNA序列分析 证据 Friend S H 等人用一个定位于13q14 11 以前用于Rb基因限制性内切酶长度多态性研究的DNA片段H3 8为探针 从人胎盘cDNA文库中筛选出一个4 7kb的cDNA片段 并同时分离出相应的基因片段的克隆 用上述cDNA为探针 可在正常人的组织DNA中看到杂交信号 而在部分的视网膜母细胞瘤的DNA中则可看到信号的缺失 证据 如果用Nouthern吸印杂交的技术来检测正常人某些组织及视网膜母细胞瘤的mRNA 可发现在前才有4 7kb的信号 而在后者则此mRNA缺失目前该cDNA的全部DNA序列已经测出 证据 李文华 WH Lee 等人 利用酯酶D的基因 通过染色体移步 chromosomalwalking 应用cDNA和单一顺序DNA片段向两侧延伸 终于分离到Rb基因的cDNA及基因片段此cDNA长4 6kb 涉及到的基因大于100kb 由27个外显子组成 从cDNA序列分析 预计可翻译出816个氨基酸组成的多肽在视网膜母细胞瘤中 不仅可见基因的部分丢失 而且可看到mRNA转录物的缺失或异常 另一方面 对Wilm瘤的研究也有所突破 Stambridge等人 应用微细胞杂交技术 首次证明了将11号染色体短臂片段导入Wilm瘤细胞 可使细胞丧失在软琼脂中生长的能力和在裸鼠体内的成瘤能力 但对瘤细胞的形态 c myc N myc及c sis的表达均无影响用其它染色体片段如13号染色体对Wilm瘤的成瘤能力并无作用实验结果表明 11号染色体上的抗瘤基因产物与肿瘤形成后期存在某种联系 对癌基因与抗癌基因的评论 如果说癌基因是一个涵义混乱不确切的命名 抗癌基因是同样的模糊不清所谓癌基因与抗癌基因都是一大类控制细胞生长和分化的基因 对其单个基因来说 它的产物所具有的功能因细胞种类甚至细胞发育阶段而异 1 癌基因与抗癌基因的相对意义同一种癌基因及其产物 在不同细胞中可起完全相反的作用 最典型的例子是ras基因及其产物p21 在成纤维细胞中已有充分证据说明 微量注入p21蛋白能使细胞迅速进入S期和开始分裂 人ras基因可使成纤维细胞和某些上皮细胞恶变 但对点突变的嗜铬细胞瘤pc12细胞 将ras基因引入或微量注射p21使恶性细胞停止分裂并开始分化 src基因对鸡成纤维细胞中的致癌作用是确定无疑的 但在胚胎发育过程中 src基因的表达神经系统的分化密切相关 估计这样的例子可能不尽是个别的 从生物学意义上来说 ras基因对成纤维细胞来说是癌基因 对交感神经切来源的pc12来说是抗癌基因 同一基因的产物 是促进生长或抑制生长 是抗癌还是致癌 似乎不取决于该基因的本身 而决定于细胞类别的差异 同时提示不同细胞中以ras基因产物的效应系统不同 因此最后的生物学功能也不同 2 促进和抑制生长物质的双重性 顾名思义 应将生长因子列入癌基因的范畴 而生长抑制因子则应属抗癌基因之列 事实上 生长因子对不同细胞的作用差别很大 除了受体的因素外 生长因子既可促进细胞生长 也可抑制细胞生长 同样 生长抑制因子既可抑制细胞生长 也可促进细胞生长 因此 不区别细胞的种类即判断哪些基因是促进或抑制生长 显然是不合理的 3 肿瘤是一种异常生长 早在上一世纪 Virchow已提出肿瘤是一种异常生长的疾病 癌细胞是一种以自主的 带有分化缺陷的持续生长的细胞癌基因与抗癌基因的研究 尤其是前者 从基因水平揭开了控制细胞生长和分化的物质基础 应该既不受癌基因或抗癌基因的概念所束缚 同时也充分利用上述研究的大量材料 来揭示肿瘤发生 评论 癌基因研究的战略及具体技术 目前癌基因的研究 极需在概念和技术上有所突破概念问题现从战略角度来讨论目前癌基因研究技术路线的得与失 并提出当前需要发展的技术路线及其可行性问题 传统的研究技术路线 1 各实验室用于分离癌基因的技术路线大体上有以下几个方面 1 癌细胞的基因组DNA 通过DNA转染后导入某些受体细胞 发生恶性转化后 组建转化细胞株的基因文库 从中分离出癌基因的克隆具体分以下几个环节 传统的研究技术路线 1环节之一 癌细胞的材料来源 文献报道 多数直接癌的体外细胞株作为材料 其优点是材料易得而且单纯 易于提取到较完整的高分子DNA 缺点是体外培养过程中 癌细胞的某些原癌基因可发生突变 新的原癌基因也可被激活 因此与体内原发性肿瘤的癌基因谱不一定相同 所以 对某种特定的癌来说 材料来源奕以原发性肿瘤为主 可以癌细胞株的研究提供相互验证 但原发性肿瘤的材料不均一 常伴有坏死 提取高分DNA有时会遇到一定困难 因此在提取DNA时应注意防止DNA的降解 传统的研究技术路线 1环节之二 高分子DNA的提取用于DNA转染的DNA 要求并不高 在转染前 还将用针筒吸抽或其它机械方法将DNA分子撕裂至60kb左右 以利于导入细胞 由于这样的处理 使用DNA转染技术获得的转化基因一般在50kb以下 这是DNA转染在技术上的限制 传统的研究技术路线 1环节之三 受体细胞的选择基因转移的常用的受体细胞为小鼠NIH3T3细胞 大鼠RAT 1细胞 仓鼠CHEF细胞 上述细胞都属成纤维细胞 少数实验已开始用小鼠肾上皮细胞 上述细胞中 NIH3T3对接受外源转化基因而发生恶性极为敏感 但自发生转化率高 过去不少作者提出责难 NIH3T3细胞为一种 非整倍体 细胞 已属非正常细胞 所以应用NIH3T3作为受体细胞大多获得的转化基因仍多属ras族 因此认为 为什么获得上述结果 另有原因 这是由于DNA转染技术本身的局限性 传统的研究技术路线 1环节之四 DNA转染目前最常用的基因转移方法是DNA转染 即将DNA直接放入培液 通过一定方式 使它进入受体细胞 DNA导入的技术有 1 磷酸钙沉淀法 原理 利用pH7 01磷酸钙形成细颗粒 DNA吸附于颗粒而被导入细胞优点 方法简便 易于重复缺点 转移导入的效率低 均在10 6 10 7之间 DNA导入的技术有 2 电穿孔技术 原理 利用高压电场 对细胞进行脉冲式处理 使细胞表面通透性改变 有利于DNA分子进入细胞其效率一般比磷酸钙方法提高二个数量级或更多 DNA导入的技术有 3 抗药基因的共转染 由于DNA导入的效率很低 最高仅10 3 因此如果共同导入抗药基因 可通过药物去除大量未被转染的细胞 在具有抗药性的细胞中选择出恶性转化细胞 而且会显著降低自发转化灶的背景数常用的抗药基因为pSV2 neo 用G418进行筛选的缺点是G418价格昂贵 传统的研究技术路线 1环节之五 转化细胞的筛选经典的方法是通过G418筛选后 在转染后21在左右 收集转化细胞灶 分别扩增 然后将转化细胞通过软琼脂生长 推测其生长能力 若获得细胞集落 将其收集后 再度扩增 达到一定细胞数后 按106 107细胞 鼠接种裸鼠 鉴定其在体内的成瘤能力 若获得阳性结果 从上述细胞株或裸鼠肿瘤中提取出DNA 经Southern转移杂交 确定是否有人的DNA顺序整合入鼠类的基因组 探针一般应用人的总DNA或Alu序列 若结果为阳性 说明获得了第一轮转化细胞株 必要时 还需用上述转化细胞株的DNA 再次转染受体细胞 进行第二轮 第三轮DNA转染 以纯化具有转化活性的人DNA序列 最近二年