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文档简介

盐析法纯化血清中IgG类抗体 1 实验目的 掌握盐析法提取血清免疫球蛋白IgG抗体的原理熟悉血清IgG提取纯化操作过程和方法 2 二 实验原理 蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同 它在一定浓度的中性盐溶液中易于沉淀 而其他蛋白质组分在此时不易沉淀 通过离心可将两者分离 3 透析法脱盐 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜 玻璃纸 火绵纸等 制的透析袋里放在透析缓冲液中进行 可不断更换缓冲液 直至杂质被除去 4 四 操作步骤 5 五 结果判断 分别测OD280和OD260处的光密度值 按照公式计算蛋白质浓度 mg ml 1 45OD280 0 74OD260IgG正常参考值 8 00 16 00g L效价可用免疫双扩散试验判断 特异性则可通过双扩 免疫电泳或交叉凝集试验进行考察 浓度也可通过免疫浊度法等检测 6 六 注意事项 盐的饱和度 影响盐析的重要因素 不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同pH值 在等电点时 蛋白质溶解度最小越易沉淀析出 蛋白质浓度 越大越易沉淀 使用盐的饱和度的极限愈低 过高也易引起其他杂蛋白共沉 温度 一般可在室温下进行 某些对热特别敏感的酶 则宜低温 7 脱盐 透析时间较长 常在低温下进行 并加入防腐剂避免变性或微生物的污染 饱和硫酸铵溶液的滴加方式 逐滴 搅拌盐析后放置时间 离心操作的速度 时间透析袋的使用 8 七 方法学评价 硫酸铵水中溶解度高 受温度影响小 不易使蛋白质变性 操作简单 为盐析中常用的中性盐硫酸铵中含有氮 会干扰蛋白质的测定 且溶液的缓冲能力差 故多用于大量蛋白的粗提 若要获得纯化的免疫球蛋白 必须经过凝胶过滤 离子交换层析
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